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核酸分子雜交的概念、基本原理、探針及類型2016/01/05

主要內容：一、分子雜交的概念二、分子雜交基本原理（一）DNA變性：1、DNA變性的方法2、增色效應3、溶解曲線4、融解溫度5、影響Tm值的因素。（二）復性：退火一、分子雜交的概念：分子雜交（molecularhybridization）指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補配對原則經過退火處理，形成異質雙鏈的過程。利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。二、分子雜交基本原理：（一）DN

轉座子標簽法克隆基因的改進2015/12/31

1轉座子及轉座子標簽法克隆基因基因標簽法克隆植物組織中的基因是較為常用的一種方法，T-DNA和轉座子均可作為基因標簽。轉座子zui早由美國的細胞遺傳學家Mc-clintock在玉米中發現，它是指基因組中一段特定DNA片段，能在轉位酶的作用下從基因組的一個位點轉移到另一個位點。轉座子不僅能在本基因組中轉座，也能轉入其它植物的基因組中。轉座的結果是使被轉入的基因失活，從而有效地誘導產生表型突變株。然后構建一個對應于突變株的基因庫，用作標簽的轉座子作為探針從基因庫中篩選相對應的克隆，分離得到相對應于變

動植物樣品的采集及DNA樣品的提取2015/12/28

7.1.動物樣品的采集及處理方法遺傳學數據在野生動物和圈養動物的保護和管理中變得日益重要。在本文中，我們總結了一些能簡便而有效地獲得樣品及數據的方法。我們在采集樣品之前，對將要進行的遺傳學分析有所了解。然而，采集者并非都是研究者，當采集地與實驗室有相當距離時，采集者常常要保存好樣品直到有合適的接受者或存放地，這就要求采集者應具備一定的經驗。首先，所有樣品均應以個體序號進行標注，并且應寫上種名、性別、采樣者姓名以及采集日期，越詳盡越好，以便同一個體的不同類數據可以相互引用，另外，地理來源的標注也很

質粒的酶切鑒定及片段回收2015/12/24

一、小量酶解反應主要應用于質粒的酶切鑒定。10ul反應體積中含1mgDNA，酶切反應體系如下：質粒dna1mL10×緩沖液1mL兩種限制酶各0.5mL+0.5mL雙蒸去離子水7mL總體積10mL[操作方法]按下列順序加入試劑：(1)在一滅菌的新的Ep管中加入7ul雙蒸水。(2)加入10×緩沖液1mL。(3)加限制酶KpnI0.5mL，SacI0.5mL。(4)zui后加入質粒DNAlmL。(5)稍離心，混合。(6)37℃水浴1—1.5h。(7)取出后電泳分析鑒定是否酶解。[注意事項](1)雙蒸水

DNA重組技術一：酶切、連接2015/12/21

實驗原理:DNA重組技術是用內切酶分別將載體和外源DNA切開，經分離純化后，用鏈接酶將其連接，構成新的DNA分子。限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。如EcoRⅠ切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端。5’…G↓AATTC…3’→5’…GAATTC…3’3’…CTTAA↑G…5’→3’…CTTAAG…5’構建DNA限制性內切酶圖譜有許多方法。通常結合使用多種限制性內切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限

五種不同的制備siRNA方法的比較2015/12/16

比較項目化學合成體外轉錄RNAseIII降解dsRNAsirna表達載體PCR表達框材料需求21-merRNAoligos(一對)29-merDNAoligos(一對)轉錄模版(200-1000bp，兩側帶T7啟動子)55-60-merDNAoligos(一對)~50-merDNAoligos(一對)全部制備/合成時間所需時間4天—2周24小時+DNAoligo合成時間1天+轉錄模版制備時間5天以上+DNAoligo合成時間~6小時+DNAoligo合成時間個人所需操作時間幾乎不需要*中等中等多

引物（primers）設計2015/12/14

引物（primers)引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區域另一端的另一條DNA模板鏈互補。引物的重要性在整個PCR體系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結合，不與其他非目的DNA結合，PCR的靈敏性要求dna聚合酶能對引物進行有效的延伸，可見引物設計好壞與PCR結果密切相關。引物設計原則引物長度一般為15-30個核苷酸，在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時應使用較長的引物，但zui多不超過50個核

DNA的限制性內切酶酶切分析2015/12/09

限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成:一種為限制性內切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列;另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA

DNA分型技術2015/11/30

自1985年英國遺傳學家AlecJeffreys建立DNA指紋技術以來，經過近20年的發展，法醫DNA分析先后已建立了DNA指紋技術，pcr擴增片段長度多態性分析技術、線粒體DNA測序和DNA蕊片等主要技術，結合其它一些新的技術方法，如MVR-PCR，PCR-SSO，SSP-PCR、DHLPC、TOMEF等，共同形成了現代法醫DNA技術。隨著新的DNA遺傳標記的不斷被發現，各種新的DNA分析、分型技術方法的建立，法醫DNA分析技術正朝著快速，準確，靈敏度和自動化程度高的方向飛速發展。1.聚合酶鏈

限制性內切酶的酶切2015/11/23

【基本原理】限制性內切酶已有百余種，每種酶有其特定的核苷酸序列識別特異性，酶的活性需Mg+2來激活。不同的酶也有許多差別：有些酶除需Mg2+外，還需ATP等其他輔助因子的激活；切割位點和識別序列間的距離不同；有的內切酶同時具有甲基化作用。根據這些差別，可將限制性內切酶分為I、II和III種類型。II型限制性內切酶只需要二價鎂離子的激活，酶在其識別序列內切割雙鏈DNA，產生的各種dna片段具有相同的末端結構，而且大多數的II型酶可提供粘性未端，有利于片段再連接，大部分II型酶所識別的序列具有反向對

基因克隆策略與引物設計原則2015/11/19

1功能基因克隆的基本策略①根據已知的脊椎動物某一特定基因的氨基酸序列的保守區域設計簡并引物，利用RT-PCR技術獲得該基因的核心片斷，將該片斷分離純化后與T載體連接，轉化大腸桿菌，挑取白色菌落，經PCR反應鑒定得到陽性克隆，送陽性克隆的PCR產物去測序，從而獲得目的基因的cDNA核心片斷的序列。②利用3’-RACE和5’-RACE技術擴增cDNA的3’末端和5’末端，將cDNA核心片斷、3’末端和5’末端進行序列拼接，從而獲得全長cDNA序列。③通過基因組PCR獲得內含子DNA序列，通過基因組步

DNA 的純度和分子量的測定2015/11/17

一、目的熟練掌握瓊脂糖凝膠電泳法。利用瓊脂糖凝膠電泳測DNA分子量和質粒dna分子純度，并熟悉各種核酸分子在瓊脂糖凝膠電泳中的位置分布和某些特性。二、原理瓊脂糖是一種直鏈多糖。它是由B—D吡喃半乳糖和3，6—脫水半乳糖以1，3—β糖苷鍵相連的雙糖聚合物，鏈狀瓊脂糖分子之間相互以氫鍵交聯。形成網絡系統。瓊脂糖帶有親水性，不含有帶電荷的基因，也不會引起核酸分子的變性，而且不吸附被分離的物質，因此成為基因工程上的凝膠劑。當核酸分子在瓊脂糖凝膠電場中時，分子上帶電基團在pH8.0條件下帶負電荷，在電場作

士鋒生物轉基因煙草的PCR檢測2015/11/10

一、材料、試劑和儀器1材料基因特異引物，轉基因煙草和野生型煙草的基因組DNA，含目的基因得質粒2試劑PCRKit3儀器PCR儀（PE2400），電泳儀，紫外照相裝置二、操作程序1.在滅菌1.5mL管中25μl滅菌ddH2O,，加入100ng-1μg轉基因煙草和野生型煙草的基因組DNA中，沸水浴5-10min。取出立即置于冰上，使基因組DNA變性充分。2．在一滅菌的0.2mL小離心管中依次加入(總體積為25ul)：10×buffer2.5μl4×dNTPs（每種2.5mM）2.0μlprimerI

目的基因片段的回收2015/11/03

6.1實驗原理dna片段的分離與回收是基因工程操作中一項重要的技術，如可收集特定酶切片段用于基因克隆或是制備探針，回收PCR產物用于再次鑒定等。理想的DNA片段回收方法應滿足以下幾個要求：（1）回收片段應有非常高的純度如從普通凝膠中分離出來的片段不可帶有即使是微量的凝膠――凝膠會抑制大部分的酶活力，對于后續DNA片段用于再酶切分析或連接均是不利的。（2）回收過程必須是嚴格的無dna酶污染的操作過程衡量的Dnase均可能使回收的目的DNA片段降解，當降解作用僅發生在粘性末端時，在凝膠電泳中是無法看

植物RNA的分離介紹2015/10/26

1.總RNA的分離總RNA分離的方法很多，常采用的是異硫氰酸胍和b-巰基乙醇這兩種RNase抑制劑來抑制RNase的活性，同時，異硫氰酸胍與十二烷基肌氨酸鈉（sarcosyl）共同作用可以破壞核蛋白復合體，使RNA順利地解脫出來溶進緩沖液。由于RNA在堿性條件下不穩定，因而在整個提取過程中體系始終保持酸性至中性，而在酸性條件下DNA極少發生解離，DNA同蛋白質一起變性后被離心下來，RNA則仍溶于上清緩沖液中，zui后用異丙醇沉淀出RNA。【試劑與儀器】（1）異硫氰酸胍溶液：4mol/L異硫氰酸胍

PCR技術的原理與方法2015/10/12

PCR定義PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈式反應，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達調控，基因多態性研究等許多方面。PCR技術的基本原理一.pcr反應成分：1.模板DNA；2.引物；3.四種脫氧核糖核苷酸；4.dna聚合酶；5.反應緩沖液、Mg2+

PCR在進化與生態學研究中的應用2015/09/23

分子分類學雖然用核酸序列數據進行分類研究的優點早已被承認，但序列比較數據的積累過程都是繁瑣的。PCR/？通用引物技術所提供的快速測序法促使分子分類學的范圍擴展到更多的類群。由序列中得出的均一數據為各種類群的生物提供了一個共同的系統發育框圖。序列數據同樣也提供了過去的方法所不能提供的分辨率。線粒體DNA的擴增和直接測序也已用地獲得序列來證明在關于人類的mtDNA家系圖中非洲人是其基礎。在另一項研究中，對靈長類型組織相容性基因的系統發育分析表明HLA-DQα基因座的許多等位基因的起源早于人類的發生。

士鋒生物PCR各處應用模式2015/09/21

一、兼并引物（Degenerateprimer）PCR密碼子具有兼并性，如表22-4，單以氨基酸順序推測編碼的DNA序列是不的，但可以設計成對兼并引物，擴增所有編碼已知順序的核酸序列。用兼并引物時寡核苷酸中核苷酸序列可以改變，但核苷酸的數量應相同。兼并度越低，產物特異性越強，設計引物時應盡量選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，針對兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的擴增、克隆和序列分析。現已成功地克隆了豬尿酸氧化酶基因、糖尿病相關肽基因和哺乳動物與禽類的嗜肝病毒基因。用脫氧肌苷（d

士鋒生物PCR的*性與局限性2015/09/18

聚合酶鏈反應即PCR技術，因為其對基因或特定核酸序列在短時間內的極大的擴增效率，已在感染性疾病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、法醫學、動植物和考古等的診斷和研究中得到了廣泛的應用，并在某些方面幾乎是難以替代的。但是，像自然界的任何事物一樣，PCR也有其局限性，稍不注意，就很容易造成錯誤的判斷。感染性疾病由病原微生物引起，主要有病毒、細菌、衣原體、支原體和螺旋體等，在PCR出現以前，這些病原體通常采用培養、免疫學方法測定特異抗原抗體，核酸雜交等進行臨床檢測，但這些方法對某些病原體要么難以進行（如導致結核

焦磷酸測序（Pyrosequencing）技術2015/09/16

焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，操作極為簡便。Pyrosequencing技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應（參見Pyrosequecing的原理），在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團（PPi）。PPi可zui終轉化為可見光信號，并由PyrogramTM轉化為一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸