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生物信息學精講之進化樹2016/05/11

分子鐘的發現對于進化研究具有十分重要的意義。它不僅能用于粗略估計不同類群生物間的進化時間，亦可用于構建進化樹。實際上，分子鐘發現不久，蛋白質序列分析即被廣泛用于生物的長時進化研究。根據蛋白質的序列或結構差異關系可構建分子進化樹(evolutionarytree)或種系發生樹(phylogenetictree)。進化樹給出分支層次或拓撲圖形，它是產生新的基因復制或享有共同祖先的生物體的歧異點的一種反映，樹枝的長度反映當這些事件發生時就存在的蛋白質與現在的蛋白質之間的進化距離。根據進化樹不僅可以研究

組織和細胞總RNA提取（TRIzol法）2016/05/09

TRIzolRNA提取試劑盒是由GIBCOBRL公司推出提取RNA的產品，其操作方便、快捷。（一）試劑準備1．TRIzol試劑。2．氯仿3．異丙醇4．75%乙醇（DEPCH2O配制）5．DEPCH2O（二）操作步驟1．樣品處理：（１）培養細胞：收獲細胞1-5×107，移入1.5ml離心管中，加入1mlTrizol，混勻，室溫靜置5min。（２）組織：取50-100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置1.5ml離心管中，加入1mlTrizol充分勻漿，室溫靜置５min。2．加入0.2

甲基化檢測方法（亞硫酸氫鹽修飾后測序法）2016/05/03

甲基化是目前的研究熱點，就我所做的一點工作并其中一點心得，與大家分享。希望能夠對大家有所幫助。*部分基因組DNA的提取。這一步沒有懸念，*可以購買供細胞或組織使用的dna提取試劑盒，如果實驗室條件成熟，自己配試劑提取*可以。DNA比較穩定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應該是完整的。此步重點在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶k及RNA酶以去除兩者。使用兩者的細節：1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml；2：rna酶必須要

測序常見問題及其分析2016/04/26

1、PCR產物測序時出現重疊峰問題圖1（模板中有堿基缺失，往往是單一位點（1-1）或兩個位點（1-2）堿基缺失導致測序結果移碼）圖1-1解決方法：將PCR產物克隆到質粒（如T載體）中挑單克隆測序，或將PCR產物進行page純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進行測序。問題圖2（PCR產物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段，長度不一）圖2

ISSR分子標記的實驗原理及操作流程2016/04/25

ISSR標記ISSR（inter-simplesequencerepeat）標記是一種類似RAPD，但利用包含重復序列并在3’或5’錨定的單寡聚核酸引物對基因組進行擴增的標記系統，即用SSR引物來擴增重復序列之間的區域。其原理具體是，ISSR標記根據生物廣泛存在SSR的特點，利用在生物基因組常出現的SSR本身設計引物，無需預先克隆和測序。用于擴增的引物一般為16-18個堿基序列，由1-4個堿基組成的串聯重復和幾個非重復的錨定堿基組成，從而保證了引物與基因組DNA中SSR的5’或3’末端結合，導致

PCR常用優化策略2016/04/19

PCR過程中如果沒有找到*的擴增條件將會導致產生許多不確定的、不需要的產物，有時甚至沒有目的產物；而在另一個，又可能沒有擴增到任何產物。這時改變已知對引物－模板的忠實性和引物延伸有影響的諸多參數中的一兩個，將會達到優化擴增的目的。其中zui主要的優化變量包括Mg2＋濃度、緩沖液pH值和循環條件，在循環條件中又以退火溫度zui為重要。1．降落PCR降落PCR代表了一種*不同的PCR優化方法，它不是用許多反應管和每管用不同的試劑濃度和循環參數，而是用一個反應管或一小組反應管，在適合于擴增目的產物而不

如何從RNA抽提到電泳鑒定2016/04/14

RNA抽提一，準備工作1，實驗器具與材料：（1）移液槍：1ml、200ul、10ul（2）吸頭：1ml、200ul、20ul（3）吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置200ul和20ul的吸頭一個（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）鹽水瓶：100ml（8）15ml塑料管一個（配75％乙醇用）2，實驗器具的處理與準備（1）塑料制品：（包括吸頭、EP管等）將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中（必要時小槍頭需要用吸管打入DEPC水）37℃，然后送至高壓3次，

siRNA的設計與制備2016/04/06

一．sirna的設計在制備siRNA前都需要單獨設計siRNA序列。研究發現對哺乳動物細胞，zui有效的siRNAs是21-23個堿基大小，3’端有兩個突出堿基的雙鏈RNA；而對非哺乳動物細胞，比較有效的是長片段dsRNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴謹，與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。選擇siRNA靶位點：從轉錄本AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個AA3’端相鄰的19個核苷酸作為侯選的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在30%-50%左右的si

各種轉染方法比較2016/03/30

轉染方法原理主要應用特點廠家及產品DEAE－葡聚糖法帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞瞬時轉染相對簡便、重復比磷酸鈣好,但對細胞有一定的毒副作用,轉染時需除血清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS細胞系sigma-aldrich(DEAE-DextranTransfectionKit)磷酸鈣法磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞穩定轉染,染瞬轉染不適用于原代細胞（所需的DNA濃度較高）,操作簡便但重復性差,有些細胞不適用細胞建議用CSCL梯度離心，

RNAi起源與專有名詞2016/03/28

發現dsRNA能夠導致基因沉默的線索來源于線蟲Caenorhabditiselegans的研究。lang=EN-US1995年，康乃爾大學的SuGuo博士和lang=EN-USKemphues在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C.elegans）中的par-1基因時，發現了一個意想不到的現象。她們本是利用反義rna技術特異性地阻斷上述基因的表達，而同時在對照實驗中給線蟲注射正義RNA（senseRNA）以期觀察到基因表達的增強。但得到的結果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達途徑。這是與傳統上對反義

RNAi技術：體外轉錄合成雙鏈RNA2016/03/21

在植物、昆蟲、原生動物體內都發現了自然存在的RNAi現象，實驗表明通過目的基因序列的雙鏈RNA可以誘導產生基因沉默現象。要制備較長的dsRNA，zui簡單的方法就是體外轉錄合成雙向的RNA。如果研究對象不是哺乳動物細胞，那要開展RNAi的實驗就要簡單很多。因為可以采用較長的雙鏈RNA誘導RNAi現象，而無需制備特定的sirna。在這里生物通將介紹幾個制備長鏈dsRNA的試劑盒。（值得注意的是在哺乳動物細胞內，大于29nt的雙鏈RNA引發的是非特異基因沉默，21nt大小的雙鏈RNA，也就是我們前面

RAPD技術及其在假絲酵母菌研究中的應用2016/03/16

近年來，隨著腫瘤、自身免疫病、器官移植、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）等患者的不斷增多，侵入性診斷治療手段的廣泛實施，各類免疫抑制劑和廣譜、超廣譜抗生素的大量使用，臨床上真菌感染呈明顯上升趨勢［1］，其中假絲酵母菌在醫院真菌感染中zui常見，占80%以上［2］，故快速、準確地對其鑒定、分型并分析該菌種間、種內的親緣關系對研究假絲酵母菌的致病性、藥物敏感性、預防監測流行病學調查具有重要意義。傳統的真菌分型方法主要是表型分型如形態學法、血清學法、藥物敏感性分型等，但耗時費力，易受環境及人為

PROTOCOL FOR NORTHERN BLOTTING2016/03/07

Developedby:ChristopherToddHittingerModifiedfrom:"Bio-RadVacuumBlotterInstructionManual"ａnd"AnalysisofRNAbyNorthernａndSlotBlottingHybridization"fromShortProtocolsinmolecularBiologyPreparation1.EVERYTHINGmustbeThoroughlycleanedofRNAses,ａnduLovesmustbe

從λ噬菌體DNA的純2016/02/29

ThisisamodificationoftheprocedureinShortProtocols(1-41,1-45)1.Preparea50mllIQuidlysate:A.mix2xlO8E.coliCellswith100ulphage(fromonepickedplaquein500ulSM),and100ullOmMMgCl2/lOmMCaCI2.Adsorbat37°for15min.B.transferto50mlLBmedium(supposedtobeNZC,we"veuse

基因分離克隆的方法2016/02/22

1基因芯片技術分離目的基因生物芯片是高密度固定在固相支持介質上的生物信息分子的微列陣。列陣中每個分子的序列及位置都是已知的，并按預先設定好的順序點陣。基因芯片是生物芯片的一種，其上固定的是核算類物質，主要用于DNA、RNA分析。分為DNA芯片和微點陣兩種。分離目的基因是是指從基因組中發現或找出某個目的（標）基因。目前是通過①比較不同物種之間，或同一物種不同個體之間；或同一個體在不同生長發育是期或不同環境條件下基因差異表達（基因表達平行分析）來實現的。采用基因芯片技術進行基因差異表達研究可以通過雜

特定基因表達水平的檢測2016/01/25

繼分析DNA的southern雜交方法出現后，1977年Alwine等人提出一種與此相類似的、用于分析細胞總RNA或含polyA尾的RNA樣品中特定mRNA分子大小和豐度的分子雜交技術，這就是與Southern相對應而定名的Northern雜交技術。這一技術自出現以來，已得到廣泛應用，成為分析mRNAzui為常用的經典方法。與Southern雜交相似，Northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的RNA分離開來，隨后將其原位轉移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（

雙鏈短RNA[dsRNA]合成方法2016/01/21

WeroutinelyproducedsRNAbyinvitrotranscriptionofaPCRgeneratedDNAtemplatecontainingtheT7promotersequenceonbothends(I.primerDesigneddsRNA).ItisalsopossibletoproducedsRNAusingPCRgeneratedDNAtemplatescontainingeithertheT7&SP6ortheT7&T3promotersoneitherend

SMART技術簡介2016/01/19

真核細胞的mRNA在加工過程中有一個比喻為“穿鞋戴帽”的過程，因此mRNA的3’末端都帶有一段PolyA，這是利用逆轉錄酶制備cdna文庫的基礎。但是由于cDNA的5’端的序列各不相同，如何獲得全長的cDNA，如何擴增由微量的mRNA逆轉錄得到的cDNA文庫、如何利用已知片斷序列得到全長的cDNA（即RACE），曾經是一個令人困擾的問題。常見的做法是在合成cDNA的雙鏈后在兩端連上接頭，利用已知的接頭序列再進行擴增，或者是利用末端轉移酶在雙鏈cDNA的3’末端加上一連串的G或者C（或者A/T），

DNA抽提標準化操作規程2016/01/14

1目的：DNA抽提標準化操作規范適用于HLA試驗中的DNA抽提操作。2適用范圍：DNA抽提實驗室3依據：DNA抽提標準化操作規范4引用文件：德國BAG公司（以下簡稱BAG）《InstructionsforuseEXTRA-GENEI》5程序5.1試劑準備5.1.1BAG®EXTRA-genEI該試劑盒包括3部分：Solution1、Solution2、Solution3使用前，若Solution2有沉淀請將其在37℃孵育，直至沉淀*溶解5.1.2乙醇溶液，濃度（V/V）為96%或100％5.1.

Southern印跡雜交2016/01/12

實驗原理核酸分子雜交技術是分子生物學領域中zui常用的具體方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。由于核酸分子的高度特異性及檢測方法的靈敏性，綜合凝膠電泳和核酸內切限制酶分析的結果，便可繪制出DNA分子的限制圖譜。但為了進一步構建出DNA分子的遺傳圖，或進行目的基因序列的測定以滿足基因克隆的特殊要求，還必須掌握DNA分子中基因編碼區的大小和位置。有關這類數據資料可應用Southern印跡雜交技術獲得。Southern