實(shí)驗(yàn)原理: DNA重組技術(shù)是用內(nèi)切酶分別將載體和外源DNA切開，經(jīng)分離純化后，用鏈接酶將其連接，構(gòu)成新的DNA分子。限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。如EcoRⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。 
5’…G↓AATTC…3’ →5’… G AATTC…3’ 
3’…CTTAA↑G …5’ →3’… CTTAA G…5’ 
構(gòu)建DNA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對(duì)位置。酶切圖譜的使用價(jià)值依賴于它的準(zhǔn)確性和程度。 
限制性內(nèi)切酶的一個(gè)活性單位U 
理論上， 1hr,切1ug DNA 樣品中所有專一位點(diǎn)的所用酶量實(shí)際反應(yīng)，1U酶：能*切割1ul λDNA的一個(gè)位點(diǎn)不能* 切割1ug 帶有4個(gè)酶切位點(diǎn)的樣品和不純的樣品.
如果采用兩種限制性內(nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的zui適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時(shí)水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。 
限制性內(nèi)切酶的使用注意事項(xiàng)： 
10x bf o 無鹽 
注意混勻 L 低鹽 
H 高鹽 
一.儀器 
水浴鍋(37℃，65℃) 凝膠電泳 滅菌鍋 紫外檢測(cè) 離心機(jī) 
二.試劑及溶液
λ DNA EcoR I
pUC18 無菌水 
終止液 (40%蔗糖) 70％，100％酒精
3Mol/L KAc(pH5.2) ICE
瓊脂糖 溴酚藍(lán)
TE TAE
EB marker
三. 用品
移液器 20ul 一次性手套
tip 20ul 防護(hù)鏡 
離心管 0.5ml 吸水紙
膠帶 浮子
PUC 18/19, λDNA
2人／組，一人做 PUC18 酶切 （20ug） Takara 25ug/個(gè)
一人作λDNA 酶切 （15ug）
EcoR1 1ul/人 （10 u） (20ul) Takara 4000u/個(gè)
四：酶切反應(yīng): 
DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí),會(huì)影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí),每次都要用新的吸管頭. 
[注意] 
1.酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶反應(yīng)。 
2、酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在zui適反應(yīng)條件下，1小時(shí)*降解1mg λDNA的酶量為一個(gè)單位，但是許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA不象λDNA那樣易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。 
3、市場(chǎng)銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1×）進(jìn)行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。

37℃,2hr
終止反應(yīng) 65℃ 10min
各取2ul酶解液，電泳
EcoRI切割λDNA后電泳得到6個(gè)片段,
長(zhǎng)度分別為 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9 和 2.5kb