一、兼并引物（Degenerate primer）PCR
密碼子具有兼并性，如表22-4，單以氨基酸順序推測編碼的DNA序列是不的，但可以設計成對兼并引物，擴增所有編碼已知順序的核酸序列。用兼并引物時寡核苷酸中核苷酸序列可以改變，但核苷酸的數量應相同。兼并度越低，產物特異性越強，設計引物時應盡量選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，針對兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的擴增、克隆和序列分析。現已成功地克隆了豬尿酸氧化酶基因、糖尿病相關肽基因和哺乳動物與禽類的嗜肝病毒基因。用脫氧肌苷（deoxyinosine；DI）引物進行PCR，可以代替編碼蛋白的多種兼并密碼子中的兼并堿基，DI的特異性主要受cDNA濃度影響。

表22-4 密碼兼并性

氨基酸

密碼子數

M、W

1

C、D、E、F、H、K、N、Q、Y

2

I

3

A、G、P、T、V

4

L、R、S

6

注：選擇使用的肽鏈避開有4～6個密碼子的氨基酸

二、套式引物（Nested Primer）PCR

用*套引物擴增15～30個循環，再用擴增DNA片段內設定的第二套引物擴增15～30個循環，這樣可使待擴增序列得到擴增，而次級結構卻很少擴增。用起始引物*或Centricon30(Amicon)分子濾過器離心，在第二套引物加入前去除*引物。此方法已成功地用來分析中國倉鼠卵巢細胞AS52的分子突變。AS52細胞含有單拷貝的細胞gpt（guanine phos－phribosy transferase）基因，與哺乳動物具有同源性。套式引物PCR減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴增，提高了擴增效率。對環境樣品中微生物檢測和單拷貝的基因靶DNA的擴增是非常有效的。

若將套式PCR的內外引物稍加改變，延長外引物長度（至25～30bp），同進縮短內引物長度（15～17bp），使外引物先在高溫退火溫度下做雙溫循環擴增，然后改換至三溫循環，使內引物在外引物擴增的基礎上作低溫火溫度的三溫循環直到擴增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時加入，兩種循環一氣呵成，等于只做一次PCR，而靈敏度與套式二次PCR無異，在我們zui近推出的PTc 51氣流式DNA熱循環儀上就可以完成全部程序。

套式一次PCR的成功，使pcr檢測的全過程可以在5h內完成，使當天出檢驗報告成為現實，也使PCR檢測走入臨床有了現實的基礎。

三、復合PCR（Multiplex PCR）

用多對引物同時擴增幾條DNA片段的方法稱為復合PCR。這一方法zui初是由Chanberlain 等檢測人的基因發展而來。Bej等隨之發展了對環境樣品中不同屬細菌相關基因序列同時PCR擴增的檢測方法。兩種不同的軍團菌（legionella）基因，一為特異嗜肺L基因（mip），另一種為L-5SrRNA基因，通過引物搖擺（staggered）添加進行復合PCR。首先mip引物PCR擴增7個循環，然后加入5SrRNA引物PCR擴增38個循環。加入不同量的LacZ和LacB基因引物進行PCR擴增可以檢測大腸桿菌和與人類糞便污染有關的細菌包括E.coli大腸菌、腸源致病沙門氏菌和志賀氏菌。