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士鋒細菌轉化實驗2015/09/09

．實驗目的細菌轉化實驗1．以pGLO質粒轉化大腸桿菌為例，學習轉化的基本原理及方法。2．驗證DNA是遺傳物質，加深對中心法則的理解。二．實驗原理轉化（transformation）是指一段同源或異源的DNA轉入受體細胞并得到表達的水平基因的轉移過程，是現代分子生物學研究和基因工程*的重要技術。目前常用的轉化方法有CaCl2法(化學轉化法)和電轉化法。本實驗是用pGLO細菌轉化試劑盒中提供的pGLO質粒來轉化大腸桿菌，所用方法為CaCl2轉化法。pGLO質粒：細菌轉化實驗pGLO質粒上主要含有兩個

DNA芯片檢測siRNA專一性2015/09/06

長片斷的雙鏈RNA(dsRNA)導入例如植物，真菌，果蠅，線蟲等生物的細胞中會引發同源mRNA的降解——這就是所謂的RNAinterference(RNAi)。RNAi分兩個步驟，首先是長片斷雙鏈dsRNAs被核酶Dicer切割成21—25個堿基的smallinterferingRNAs(sirnas)。這些siRNA隨后和相關蛋白組合成為RNA-inducedsilencingcomplex(RISC)，這個復合物以同源mRNA為靶摧毀mRNA。兩年前ElbashirａndTuschl用siR

士鋒RNAi及其在植物遺傳改良中的應用2015/09/01

RNAi即RNA干涉(或RNA干擾)是指雙鏈RNA導入細胞后并被切割成21～23個核苷酸長度的短核苷酸雙鏈，在其它作用因子的參與下能夠特異地與其同源的mRNA結合并導致其降解，從而使得內源基因不能表達，導致內源基因的沉默。自1998年Fire等在線蟲中發現并闡明以來，RNAi已經在其它動物、植物和真菌中被證實。研究表明參與該過程的許多基因具有高度的保守性，這可能是生物調控基因表達及抵御病毒侵染或轉座子誘導DNA突變的一種共有的古老生理機制。RNAi所具有的特異性、穩定性、、快速以及不改變基因組的

士鋒PCR問題的總結2015/08/20

PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。假陰性，不出現擴增條帶pcr反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及，④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不*。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，

士鋒PCR技術：PCR產物測序2015/08/05

PCR技術代替了為測序而反復進行的分子克隆和模板制備步驟。PCR技術與自動測序技術相結合后，它將成為一種zui快、zui有效的測定核苷權序列的方法。本章主要綜述各種測模板的制備以及如何完成PCR產物的直接測序。與傳統的將PCR片段克隆入質粒或病毒基因組相比，直接序列分析有兩個主要的優點:1)由于它是一個不依賴于生物體(如細菌、病毒等)的體外系統，因而它更容易標準化(即例于自化2);對于每個待測樣品，只需測定一個單鏈序列，因而它也就更快和更準確。相比之下，間接測序為了區別在PCR反應過程中由dna

士鋒RNAi技術初探2015/07/27

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是近年來發現的研究生物體基因表達、調控與功能的一項嶄新技術，它利用了由小干擾RNA(smallinterferingRNA，sirna)引起的生物細胞內同源基因的特異性沉默(silencing)現象，其本質是siRNA與對應的mRNA特異結合、降解，從而阻止mRNA的翻譯。RNAi是生物進化的結果，是生物體對病毒基因等外源核酸侵入的一種保護性反應。它普遍存在于各種生物，具有抗病毒、穩定轉座子及監控異常表達ｍRNA的生物學功能。RNA干擾現象不

穩定表達具有生物活性的人重組對氧磷酶2015/07/24

INTRODUCTIONSerumparaoxonase-1(PON-1)isahigh-densitylipoprotein(HDL)-associatedcalcium-dependantesterasewithantioxidantａndanti-atherogenicproperties.Theactivityofparaoxonase-1hasbeenimplicatedinthepathogenesisofmanydiseasestates,includingmetabolicsyn

葡萄糖醛酸-轉移酶活性的測定2015/07/20

葡萄糖醛酸轉移酶是指能催化間接膽紅素與葡萄糖醛酸結合形成葡萄糖醛酸酯(即直接膽紅素）的酶。

液相色譜之排阻液相色譜2015/07/15

液相色譜（HighRerformanceLiquidChromatography,HPLC）又叫高壓、高速、近代液相色譜，通常叫做液相色譜。它是60年代中期才建立的一種快速分離化合物的方法，到了70年代后期才廣泛用于蛋白質的分離純化方面，現已成為分離純化蛋白質非常有效的方法之一。和經典常壓色譜相比它有以下特點：1、HPLC分離、純化蛋白質的速度快。通常半小時左右可進行一次，大大縮短了純化蛋白質的時間；2、分辯率高。一根長10cm的色譜柱可分離十幾種以上的物質；3、適應面廣，靈活性強，幾乎所有的蛋

士鋒蛋白質的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗2015/07/07

[原理]蛋白質在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開，形成按1.4gSDS/1g蛋白質比例的SDS-蛋白質多肽復合物，該復合物帶負電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移，且主要由于凝膠的分子篩作用，遷移速率與蛋白質的分子量大小有關，因此可以濃縮和分離蛋白質多肽。聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質多數采用一種不連續的緩沖系統，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液，其pH值和離子強度也相應不同，故電泳時，樣品中的SDS-多肽復合物沿移動的界面移

士鋒PVDF膜上蛋白的可逆染色2015/06/29

Western雜交時，為確認蛋白是否轉至PVDF膜上，可用下列方法對膜上蛋白進行可逆性染色。1.氨基黑染色染液：0.5%AmidoBlack(w/v),25%isopropanol(v/v)ａnd10%aceticacid.染色：將PVDF膜置于染液中染色數鐘，ddH2O脫色。2.考馬氏亮藍染色染液：0.1%CoomassieBrilliantBlueR-250(w/v)ａnd50%methanol(v/v)脫色液：40%methanol(v/v)with10%aceticacid(v/v)染色

蛋白質組分析中的初步分離2015/06/23

在分析質譜產生的二維圖譜上的蛋白質斑點時，看起來似乎只有通常含量比較高的蛋白質(編碼偏倚指數大于0.2)才能*被鑒定出來。因而，二維膠上的斑點數量不能代表可以分析的全部表達的基因的數量或種類。Gygi等(2000)曾經計算過，在二維作圖的早期階段，如果只裝入40ug酵母溶出產物，那么只有豐度超過至少51000拷貝(每個細胞)的多肽才能被檢測到。如果起始的蛋白質總量是0.5mg，那么豐度超過1000拷貝(每個細胞)的蛋白質就可以通過銀染看到，但是那些每個細胞含100拷貝和10拷貝的都不能再現出來。

新型人造酶可用于標記蛋白2015/06/15

使用一種不被自然利用的稀有金屬，萊斯大學的化學家們發明了一種合成酶，有助于解開難以研究的數千種蛋白質的身份，其中包括許多在癌癥和其他疾病發揮關鍵角色的蛋白質。這項研究zui近在線發表在《美國化學學會雜志》上。“我們已經將銠的化學性能和目前生物學已知能識別和選擇的特定蛋白結合在一起，”共同研究作者ZacharyBall，萊斯大學化學助理教授說，“結果是一種工具，在許多方面，比任何單獨使用生物或化學的方法更有效。”Ball三年前開始研究雙銠催化劑。他一開始沒有試圖用它們們來合成酶，但他對一個研究產生

水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA2015/06/09

實驗原理閉合環狀質粒、線性質粒和開環質粒DNA由于構形不同，在加溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳上呈現不同的遷移率，因而在紫外燈下觀察，能區別閉合環狀質粒DNA（cccDNA）、線性質粒DNA（L-DNA）和開環質粒DNA（ocDNA）。實驗步驟1.選擇合適的水平式電泳槽，調節電泳槽平面至水平。檢查穩壓電源與正負極的線路。2.選擇孔徑大小合適的點樣梳子，垂直架在電泳膠模的一端，使點樣梳子底部離電泳膠模底部的距離為1.0mm。3.制備0.7%瓊脂糖凝膠，100℃水浴加熱至瓊脂糖融化均勻。4.用吸管取少量瓊

PPO粗酶液的純化2015/06/03

一、原理1.葡聚糖凝膠SephadexG-200凝膠柱層析利用大分子不能進入凝膠顆粒內部zui先流出柱外，而小分子物質進入凝膠顆粒內部，流速慢而zui后流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質分離開。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質）2.利用離子交換法，選取DEAE-陰離子纖維素DE52柱材料，因為PPO是帶有陽離子的蛋白質，在層析時會吸附在柱材料上，而雜蛋白會洗下。后用NaCl梯度洗脫PPO，（NaCl為強離子交換劑，能將弱吸附在柱材料上的PPO置換下來）。粗酶液從而得到

SDS-PAGE膠染色2015/06/01

一、各種蛋白染色方法的靈敏度比較染色方法靈敏度與質譜的兼容性Silver1-10ng-Silver(MScompatible)10ng+ComassieG-250orR-25030ng+Antibody(Westernblot)1ng-二、考馬斯亮藍染色CBB染色液：0.5%考馬斯亮藍G250或R250；40%甲醇；10%乙酸；將CBB溶于甲醇中并不停的攪拌15min。加入乙酸與ddH2O脫色液：30%甲醇；10%乙酸染色方法：1.在搖床上染色30min；2.脫色至蛋白點或條帶清晰可見；3.dd

雙向電泳溶液配制方法2015/05/29

A.裂解液(lysissolution)(8MUrea,4%CHAPS,2%Pharmalyte3-10,40ml)FinalconcentrationAmountUrea(Fw60.06)8M19.2gCHAPS4%(w/v)1.6gPharmalyte3-102%800μlDoubledistilledH2OTo40ml新鮮配制或者分裝貯存于-20℃①如果需要，尿素的濃度可以調高到9或者9.8M，也可用7MUrea，2MThoiurea。②其他的去垢劑（如TritonX-100，NP-40，

測定蛋白濃度2015/05/25

一、實驗原理雙縮脲法（Biuret法）和Folin―酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度zui高的蛋白質測定法。考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的zui大吸收峰的位置（lmax），由465nm變為595nm，溶液的顏色

重組細胞因子分類及應用概述2015/05/21

、細胞因子的概念細胞因子(cytokine)是由機體多種細胞分泌的小分子蛋白質，通過結合細胞表面的相應受體發揮以調節免疫應答為主的生物學作用。細胞因子具有非常廣泛的生物學活性，包括促進靶細胞的增殖和分化，增強抗感染和細胞殺傷效應，促進或抑制其它細胞因子和膜表面分子的表達，促進炎癥過程，影響細胞代謝等。二、細胞因子的命名細胞因子按其來源可分為：由單個核吞噬細胞產生的細胞因子稱為單核因子(monokine)；由淋巴細胞產生的細胞因子稱為淋巴因子(lymphokine)等。按其作用可分為干擾素、集落刺

瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA2015/05/19

目的：學習水平式瓊脂糖凝膠電泳，檢測質粒DNA的構型、分子量的大小。原理：瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，可作為電泳支持物，適用于分離大小范圍在0.2-50kb的DNA片段。DNA分子的遷移率與分子量的對數值成反比關系。觀察其遷移距離，與標準DNA片段進行對照，就可獲知該樣品分子量大小。在質粒抽提過程中，由于各種因素的影響，使質粒DNA呈現超螺旋的共價閉合環狀、開環狀分子、線狀分子三種不同的構型，這三種分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋型遷移速度zui快，其次為線狀分子，zui慢