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【感受態細胞的制備】 用CaCl2處理制備新鮮的大腸桿菌感受態細胞2013/05/15

1.從37℃培養16~20h的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52），或1ml新鮮的16~20h過夜培養物，轉到一個含有100mlLB培養基的1L或500ml培養瓶中。于37℃振搖培養約2~3h（旋轉搖床200~300r/min），每隔20~30min測量OD600值≈0.4。2.在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，冰上放置10~20min。3.于4℃4000轉/分離心10min，回收細菌細胞。4.將管倒置1min，以使zui后殘留的痕量培養液流盡。5.以10

【感受態細胞的制備】 電擊和熱擊感受態細胞的制備2013/05/15

實驗試劑LB培養基，KB培養基，10%甘油，液氮，0.1MCaC12溶液實驗設備超凈工作臺，搖床，離心機，250mL離心瓶，0.5mL的離心管實驗材料大腸桿菌，農桿菌和假單胞桿菌實驗步驟1.電擊感受態細胞的制備1）-80℃保存的大腸桿菌，農桿菌或者假單胞桿菌在固體平板上（DH，BL21在LB平板上，GV3101在LB/Gen;P.s.pv.tomato0288-9和P.syringaepv.tabaci6505在KB平板上）劃線。2）接種單克隆于5-10mL液體培養基，37℃（大腸桿菌）或者28

細胞表面抗原染色2013/04/24

細胞表面分子流式檢測步驟說明注意事項1．在使用抗體之前，快速甩動一下，使之聚集到管的底部；2．熒光標記的抗體應該避光保存在4℃，不要冷凍；3．當染色的時候，固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號。為了得到更好的結果，染色后應該馬上分析。過程概述：1．制作外周血、淋巴組織或者培養細胞的單細胞懸液；2．細胞染色抗體（包括直接標記抗體和間接標記抗體）；3．洗滌步驟棄掉所有的為束縛的試劑4．運行分析流式儀。注意：流式細胞染色實驗中，所有實驗條件的優化都很重要。關鍵參數包括靶細胞、抗體效價以及動力學。試

流式胞內染色實驗方法2013/04/24

方案A：兩步法胞內（細胞質）蛋白染色。方案B：一步法胞內蛋白染色（細胞核）。注意：1、不同細胞因子的刺激條件是不同的，比如：LPS刺激活化單核細胞分泌IL-6的培養時間一般是6個小時，而檢測IL-10則需要刺激24小時。2、結合熒光的流式抗體應在4度，避光儲存。3、使用抗體前請低速離心30秒，使貼壁抗體沉底。不建議斡旋混勻抗體，可用手指輕彈混勻。4、除非方案中注明，默認的抗體孵育方法是冰上或4度避光。5、緩沖液中加BSA或FBS可以減少固定破膜后的非特異性背景。方案A:兩步法胞內（細胞質）蛋白染

流式表面抗原染色方法2013/04/24

方案A：細胞懸液的表面抗原染色。方案B：一步法胞內蛋白染色（細胞核）。小貼士：1、流式抗體要儲存于避光4度，嚴格避免凍融。2、流式抗體使用前要離心3min，避免貼壁蓋的損失，請勿斡旋混勻。3、避免細胞成團，以免堵塞流式細胞儀。4、eFluor納米晶體抗體參照該品說明進行改善。方案A:細胞懸液的表面抗原染色實驗材料：15×75mm圓底流式管或96孔板直標一抗或純化抗體二抗（可選）抗小鼠CD32/16抗體（eBioscienceCat.No.14-0161）人FC?R結合抑制劑（eBioscienc

流式檢測細胞樣品的制備2013/04/24

方案A：組織培養細胞的制備。方案B：淋巴組織細胞制備。方案C：非淋巴組織細胞制備。方案D：全血PBMC的分離。小貼士1、流式細胞儀檢測需要將細胞制備成單細胞懸液。2、避免細胞成團，以免堵塞流式細胞儀。3、實體組織制備單細胞懸液需要物理方法分離或酶消化法進行，具體組織的方法，依照經驗來進行。方案A:組織培養細胞的制備實驗材料：Accutase™酶細胞分離培養基（eBioscienceCat.No.00-4555）eBioscience®流式染色緩沖液（eBioscienceCat.No.00-42

CaspGlow 實驗參考方案2013/04/24

以CaspGLOW™FluoresceinActiveCaspase-3StainingKit（88-7004）為例。1.根據文獻中方法誘導靶細胞凋亡，準備未誘導細胞作為陰性對照，另外一種陰性對照用1ulZ-VAD-FMK抑制劑制備。2.將細胞加入300ul*培養基中，濃度為1×106.3.加1ulFITC-DEVD-FMK在5%CO237攝氏度下孵育30~60min.4.3000rpm，5min,移去上清。5.加入0.5mlwash-buffer洗滌細胞一次。6.重復步驟4和步驟5.7.流式細

各種細胞免疫檢測方法比較2013/04/15

類型檢測名稱檢測方法主要特點體內功能檢驗遲發型超敏反應法皮下注射抗原或者負載抗原的DC，觀察紅斑、硬塊的發生與大小優點：體內功能性檢驗，相對比較容易操作；缺點：只是一種初篩，加陽性與假陰性比較嚴重。體外表型檢測TCR可變區分析法使用針對T細胞受體（TCR）可變區的流式抗體來對表達特定可變區的T細胞計數優點：可以提供關于可變區使用的群體分布；缺點：識別同一種抗原的TCR的可變區可能不相同；單抗不夠豐富，不能檢測所有種類的可變區。多肽MHC四聚體法（Tetramer）用熒光標記的MHC-肽四聚體去結

重組細胞因子溶解小帖士2013/04/15

1．離心（Centrifuge）：高速離心（10,000rpm）20-30秒，或低速離心（2,000rpm）5分鐘。2．溶解（Reconstitution）：用去離子水或其它緩沖液（根據說明書要求進行選擇）溶解至說明書要求的濃度（一般為0.1-1.0mg/ml）。溶解時不可振蕩，避免因化學鍵的斷裂造成蛋白失活，可加入適當的溶劑輕搖并靜置一段時間，待細胞因子*溶解后使用。溶劑的選擇：1）要求用去離子水溶解的產品，務必不可用鹽溶液，避免過高的鹽濃度造成蛋白不可逆的析出；2）要求用鹽溶液溶解的產品，請

PeproTech重組細胞因子常見問題解答2013/04/15

PeproTech公司的重組細胞因子產品經過了十分嚴格的生產、純化及質檢過程，保證其在投放市場之前，達到如下要求：1.真實性：重組蛋白產品一致經過N末端氨基酸序列分析；必要時應用SDS-PAGE,RP-HPLC和質譜（MS）檢測其真實性。2.純度：應用SDS-PAGE和RP-HPLC方法分析產品純度。3.生物活性：進行相應的體外（invitro）或體內（invivo）活性檢測。4.蛋白含量：通過紫外光譜分析，SDS-PAGE電泳檢測；必要時應用HPLC定量標準蛋白溶液。5.內毒素：kinetic

抗原修復技術在免疫組化中的應用2013/04/15

福爾馬林固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。同時，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質分子間相互交聯形成大分子網絡，也導致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得相當部分的抗原不能與抗體很好是進行反應。因此，抗原修復也是影響免疫組化染色結果的基本因素?？乖迯停ˋntigenretrieval，AR）技術，建立在Fraenkel-conrat等人[1]一系列生物化學研究，經1991年shi等人[2]發展?？乖迯褪侵甘灐⒈鶅?、火棉膠、塑料切片免疫組織化學（IHC）前

RNA干擾技術及其應用2013/04/15

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是正常生物體內抑制特定基因表達的一種現象，它是指當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA（doublestrandedRNA，dsRNA）時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默的現象，這種現象發生在轉錄后水平，又稱為轉錄后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS）。外源dsRNA進入細胞后產生的小分子干擾RNA（smallinterferingRNA,siRNA）的反義鏈和多種核酸酶形

TUNEL法 檢測細胞凋亡2013/04/02

細胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH

DNA的片斷化檢測2013/04/02

細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發生濃縮,染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成50~300kbp長的DNA大片段,或180~200bp整數倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜（DNAladder）。細胞經處理后，采用常規方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNAladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNAlad

線粒體膜勢能的檢測2013/04/02

線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯反應過程中zui早發生的事件，它發生在細胞核凋亡特征（染色質濃縮、DNA斷裂）出現之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine123、3，3-Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarb

磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）2013/04/02

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中（圖3）。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶（propidineiodide,PI）是一種核酸染料，它不能

細胞凋亡的形態學檢測2013/04/02

細胞凋亡檢測方法細胞凋亡與壞死是兩種*不同的細胞凋亡形式，根據死亡細胞在形態學、生物化學和分子生物學上的差別，可以將二者區別開來。細胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法。一、細胞凋亡的形態學檢測根據凋亡細胞固有的形態特征，人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態學檢測方法。1光學顯微鏡和倒置顯微鏡（1）未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。（2）染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、

2013年Pierce蛋白組學新產品推薦2013/03/19

2013年Pierce蛋白組學新產品為了更好地推動蛋白質組學研究的發展，ThermoScientificPierce推出了一系列產品。這些產品都是根據Pierce使用者的實際反饋意見來進行設計的，將給您的實驗帶來更大的便利。2013年我們將不斷推出產品的*方案以及更多的應用數據，敬請期待。細胞活性和基因調控檢測PierceLDHCytotoxicityAssayKit—簡單、可靠的比色檢測試劑盒,可用于細胞毒性的定量分析alamarBlueCellViabilityAssayReagent—快速

R&D Systems DuoSet® ELISA Kit 選購注意事項2013/03/19

一、什么樣的客戶適合選用DuoSetELISA?主要為客戶篩選高通量的指標而設計的，適合熟悉ELISA研發的實驗人員使用。沒有ELISA經驗，進行ELISA檢測的客戶不建議使用。二、DuoSetELISAKit里面一共有多少塊板子？1個DuoSet試劑盒包含的試劑可以滿足大約15塊96孔微孔板的檢測。三、DuoSetELISAKit檢測的樣本類型是什么？檢測樣本類型：細胞培養的上清液熟悉ELISA研發的實驗人員已成功將其推廣到血清和血漿樣本的使用。如果要決定試劑盒是否可用于組織勻漿（或其它未經檢

磁珠式菌種保藏管使用方法2013/03/19

我公司代理加拿大PULSE的菌種保藏管產品。其使用方法圖示如下：