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質粒抽提過程中內毒素如何去除？2022/05/28

內毒素，即脂多糖或LPS，是革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌）細胞膜的組成部分。細菌外膜的外層脂質部分是*由內毒素分子所構成的。單個大腸桿菌細胞約包含兩百萬個LPS分子，每個LPS分子由疏水的脂質A（lipidA）部分、復雜的糖類殘基陣列部分及負電性的磷酸基團所組成。因此，每個內毒素分子都具有疏水域、親水域和電荷域，這使它在與其他分子相互作用時具有其*的自身性質。細菌在其活性生長期向其周圍微環境中散布少量的內毒素，在死亡時則釋放大量內毒素。在質粒制備的細菌細胞裂解過程中，內毒素分子被從外膜釋放到溶菌液中

原代培養經驗分享2017/08/02

經驗分享：1.原代細胞鋪満瓶底后棄原液，PBS沖洗2次。2.加入0.25%Trypsin-0.02%EDTA,量覆蓋瓶底即可，室溫作用，鏡下觀察至組織塊周圍的細胞回縮，立體感增強。3.棄去消化液，PBS輕漂一遍(目的是除去EDTA，它對脆弱的原代細胞很不好)但不要用力搖晃，以免部分消化稍過的細胞流失。4.加入培養液吹打，不要產生氣泡，對細胞有損。5.吸出2/3的懸液傳入新瓶。6.向原瓶中余下的1/3細胞懸液中補加2/3的新培養液，與未消化的組織塊繼續培養。7.24小時內新的細胞又從組織塊中爬出啦

體外細胞的原代培養、凍存和復蘇，傳代培養2017/08/02

三、實驗結果計算1.一只小鼠可獲得（1～2.5）×108個脾細胞。2.細胞接種后一般幾小時內就能貼壁，并開始生長，如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。3.一般情況，傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養瓶壁上，2～4天就可在瓶內形成單層，需要再次進行傳代。四、注意事項1.取材要求新鮮，無菌，解剖小鼠時，注意不要損傷脾臟及其周圍的臟器，尤其是腸道等，防止污染脾臟。2.沖洗脾臟時要盡量洗凈血污，去除無用組織，并要防止組織干燥。3.碾磨后及時用清水沖洗篩網，防止組織、細胞阻塞網孔。4.計數前

體外細胞的原代培養、傳代培養、凍存和復蘇22017/08/02

一、實驗原理細胞培養可分為原代培養和傳代培養。直接從體內獲取的組織細胞進行培養為原代培養；當原代培養的細胞增殖達到一定密度后，則需要做再培養，即將培養的細胞分散后，從一個容器以1：2或其他比率轉移到另一個或幾個容器中擴大培養，為傳代培養，傳代培養的累積次數就是細胞的代數。細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以zui大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或DMSO作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少

定量PCR實驗技術分享12017/08/02

1.如果擴增曲線ct值比較靠后的話，32左右，一般有什么方法解決沒有ct值比較靠后，對實驗有一定的影響，因為經過那么多次的循環，酶的活性有可能有所下降，這時候擴增效率會有所改變（而定量PCR的理論基礎就是每次循環的擴增效率我們認為是確定的一個值）。因此能夠把ct值往前移。解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽干之后用少量水去溶解。2.為什么合成的引物做不加摸板的對照也能擴增出目的條帶，而內參用同樣體系就沒有呢?引物被污染。3.實時定量PCR，熒光定量PCR，實時熒光定量PCR，real－timePCR

實時熒光定量PCR具體實驗步驟12017/08/02

1樣品RNA的抽提①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。②兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10

單細胞凝膠電泳標準操作32017/03/02

實驗原理在細胞核中，DNA是環狀附著在核基質上，細胞裂解過程中，核基質被溶解、抽提，DNA的結構則未發生變化。如果DNA鏈上存在缺口，則使DNA超螺旋變的松弛，DNA環向外展，同時由于暴露了陰電荷，在電場力的作用下，松動的DNA環向陽極遷移，但是由于這種松動的DNA環一端仍附著于核DNA，其遷移距離受到限制，因此尾長并不總是真實反映鏈缺口的多少。實際應當依靠尾長與尾部的熒光強度同時來進行分析。實驗步驟1.分離制備單細胞懸液：1)體外培養的細胞株：用胰酶消化，吹打成單細胞懸液；2)體內臟器細胞：處

多克隆抗體的免疫電泳操作流程2016/08/03

實驗原理免疫電泳又稱為γ球蛋白電泳或免疫球蛋白電泳技術，這是一種能夠判斷血液中三種免疫球蛋白IgM,IgG,IgA含量水平的實驗方法。在這項實驗技術中，首先利用蛋白質的分子量和所帶電荷的比值運用水平瓊脂糖凝膠電泳技術將蛋白質進行分離，然后將特異性的抗體引入到與電泳方向平行的凹槽中，在抗原和抗體的擴散過程中，抗原和抗體適當比例的結合會導致沉淀的產生。0.85%鹽不僅可以終止擴散過程也可用于洗去未結合的蛋白，抗原和抗體結合所形成的沉淀線即可以肉眼觀察也可利用染色方法觀察。免疫電泳技術不僅可用于血清或

PCR擴增產物的鑒定2016/08/03

實驗原理生物大分子如蛋白質、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中．它們的凈電荷取決于介質的H濃度或與其他大分子的相互作用。在電場中，帶電顆粒向陰極或陽極遷移．遷移的方向取決于它們帶電的符號．這種遷移現象即謂電泳。遷移的方式目前可以根據分子尺寸大小、分子所帶的電荷或分子的生物學與化學特性分為三類。如果把生物大分子的膠體溶液放在一個沒有干擾的電場中，使顆粒具有一定遷移速率的驅動力來自于顆粒的有效電荷Q和電位梯度E。它們與介質的摩擦阻力f抗衡：在自由溶液中，這種抗衡服從斯托克斯定律。f=6πrvη這里v是

單細胞凝膠電泳標準操作2016/08/03

實驗原理在細胞核中，DNA是環狀附著在核基質上，細胞裂解過程中，核基質被溶解、抽提，DNA的結構則未發生變化。如果DNA鏈上存在缺口，則使DNA超螺旋變的松弛，DNA環向外展，同時由于暴露了陰電荷，在電場力的作用下，松動的DNA環向陽極遷移，但是由于這種松動的DNA環一端仍附著于核DNA，其遷移距離受到限制，因此尾長并不總是真實反映鏈缺口的多少。實際應當依靠尾長與尾部的熒光強度同時來進行分析。實驗步驟1.分離制備單細胞懸液：1)體外培養的細胞株：用胰酶消化，吹打成單細胞懸液；2)體內臟器細胞：處

RNAi實驗原理與方法2016/05/25

通過生化和遺傳學研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應階段(inititationａndeffectorsteps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。證據表明；一個稱為Dicer的酶，是RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個

酸性磷酸酶的顯示方法2016/05/25

實驗試劑1.10％中性福爾馬林(pH6．8～7．1)甲醛10ml蒸餾水90ml醋酸鈉2g2.酸性磷酸酶作用液蒸餾水90ml0．2mol／L醋酸緩沖液(pH4．6)12ml5％*2ml3.2％β—甘油磷酸鈉4ml先將蒸餾水和醋酸緩沖液混合，隨后分成大致相等的兩份，一份中加*溶液，另一份加甘油磷酸鈉溶液，然后再將兩者緩緩混合，邊混邊攪勻后若酸堿度值不到pH5．0，可加少量醋酸的調整。此作用液在臨用前配制，不能貯存。配好后的作用液應透明無絮狀懸浮物和沉淀，否則將嚴重影響實驗結果。4.1％硫化胺溶液硫化

IEF分離蛋白質2015/12/04

實驗試劑樣品提取液（8M尿素、2％非離子型去污劑NP－40、2％Ampholin，pH3.5-10、2％DTT）膠母液（30％的29/1的Acr/Bis），兩性電解質陽極緩沖液1M磷酸陰極緩沖液1M氫氧化鈉固定液（10％的三氯、1％的磺基水楊酸）染色液（35％乙醇、10％冰醋酸、0.15%考馬氏亮藍R250）脫色液（35％乙醇、10％冰醋酸）實驗設備高壓電泳儀、IEF槽、離心機等實驗步驟1.樣品提取1)1ml原核表達細胞液離心取沉淀2)沉淀用100ulIEF樣品緩沖液裂解，離心取上清2.制膠1)

土壤中有機氯農藥的分析方法2015/12/04

實驗試劑丙酮、正己烷（J.T.Baker公司）均為農殘級；甲醇（Fisherchemical公司）為色譜純；銅片為分析純(臨用時，先用6mol/L的鹽酸去除其氧化層，用去離子水洗至中性，然后依次用甲醇、丙酮、正己烷洗滌3次)；無水硫酸鈉為分析純（400℃烘4h，冷卻后儲于密閉容器中）；硅膠為分析純（先用甲醇洗滌，然后用二氯甲烷洗滌，在110℃烘干過；使用前在250℃烘24h，冷卻后儲于密閉容器中）。Florisil小柱（SUPELCO公司），1000mg(6mL)；20種有機氯混合標準溶液（Ac

ABO血型的鑒定2015/12/04

實驗原理ABO血型是根據紅細胞表面存在的凝集原決定的。存在A凝集原的稱為A血型，存在B凝集原的稱為B血型。而血清中還存在凝集素。當A凝集原與抗A凝集素相遇或B凝集原與抗B凝集素相遇時，會發生紅細胞凝集反應。一般A型標準血清中含有抗B凝集素，B型標準血清中含有抗A凝集素，因此可以用標準血清中的凝集素與被測者紅細胞反應，以確定其血型。同種動物不同個體的紅細胞凝集稱為同族血細胞凝集作用。不同動物的血液互相混合有時也可產生紅細胞凝集，稱為異族血細胞凝集作用。對于動物的天然血型抗體了解不多，而且免疫效價也

霉菌的形態觀察2015/12/04

實驗原理霉菌菌絲較粗大，細胞易收縮變形，而且孢子很容易飛散，所以制標本時常用乳酸石炭酸棉藍染色液。此染色液制成的霉菌標本片其特點是：(a)細胞不變形；(b)具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保持較長時間；(c)溶液本身呈藍色，有一定染色效果。霉菌自然生長狀態下的形態，常用載玻片觀察，此法是接種霉菌孢子于載玻片上的適宜培養基上，培養后用顯微鏡觀察。此外，為了得到清晰、完整、保持自然狀態的霉菌形態還可利用玻璃紙透析培養法進行觀察。此法是利用玻璃紙的半透膜特性及透光性，將霉菌生長在覆蓋于瓊脂培養基表面的

玫瑰花環試驗2015/08/27

實驗原理動物T淋巴細胞表面具有結合異種動物紅細胞的受體，稱為E受體，在體外一定條件下，能與綿羊等動物的紅細胞結合，形成以T細胞為中心，紅細胞環繞在周圍，宛似一朵玫瑰花樣的花環，故取名為E玫瑰花環試驗(erythrocyterosettesassay)或自然花環形成試驗。凡能與RBC形成E花環的淋巴細胞稱E花環形成細胞(Erosetteformingcell，ERFC)。目前*綿羊紅細胞(SRBC)受體是人、騾、牛、山羊、豬等T淋巴細胞的特異標志，ERFC就是T細胞。這種玫瑰花環形成不需任何物質的

細胞凝集反應2015/08/27

實驗原理細胞質膜是由蛋白質不同程度鑲嵌在脂雙層中所形成的動態流動結構，蛋白質和脂類分子又與寡糖鏈結合為糖蛋白和糖脂分子，糖蛋白和糖脂分子伸至細胞表面的分枝狀寡糖鏈在質膜表面形成細胞外被（又稱為糖萼）。許多研究結果表明：細胞間的分子識別、細胞的生長和分化、免疫反應和腫瘤發生等均與細胞外被（分枝狀寡糖鏈）有關。凝集素（lectin）是一類含糖的（少數凝集素例外）并能與糖進行專一性結合的蛋白質，它具有凝集細胞和刺激細胞分裂的作用。凝集素促使細胞凝集主要是由于它能與細胞外被的糖分子相連接、在細胞間形成“

細菌的革蘭氏染色和特殊形態觀察2015/08/27

實驗原理染色方法：革蘭染色法是細菌學中zui廣泛使用的一種鑒別染色法。1884年由丹麥醫師Gram創立。方法是先將細菌用結晶紫染色，加媒染劑（增加染料和細胞的親和力）后，用脫色劑（酒精或丙酮）脫色，再用復染劑染色。如果細菌不被脫色而保存原染液顏色者為革蘭陽性菌(G＋)；如被脫色，而染上復染液的顏色者為革蘭陰性菌(G-)。此染色法可將所有具有細胞壁的細菌分為兩大類：革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。單染色法：只能觀察微生物的大小、形狀、和細胞排列狀況，但不能鑒別微生物以及它的特殊構造等。復染色法：用兩種或兩

冷凍組織切片制作2015/08/27

實驗試劑液氮，干冰，1％明膠，4％多聚甲醛，PBS，含1％NP-40的PBS，3％BSA／PBS稀釋抗體，辣根過氧化物酶標記的二抗，DAB／金屬鹽試劑，3％過氧化氫，0.3％(W／V)氯化鎳貯存液，Harris蘇木精，乙醇實驗設備載玻片，Whatman1＃濾紙，低倍光學顯微鏡實驗材料未受損傷的組織實驗步驟1.將未受損傷的組織切剖成小樣本，約lcmXIcmX0.4cm。2.將標本放在卡片的一端。標記該卡片，將帶有標本的一端浸入液氮中。60s后，取出標本并放在干冰上。修剪卡片，使其大小剛好比組織塊稍