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DNA實驗技術：原位雜交實驗要求及步驟22013/08/06

三、操作步驟（一）取材、冰凍切片：將動物以3%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（見圖2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1MPBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）。將組織塊入30%蔗糖/0.1MPBS液（4℃），1-2天后冰凍切片，將切片裱貼于原位雜交玻片上，切片厚度為15-20μm。（二）探針制備與檢測（定量）：1.隨機引物制備cDNA核酸探針以DIGDNA標記檢測試劑盒

DNA實驗技術：原位雜交實驗要求及步驟12013/08/06

原位雜交組織（或細胞）化學（InsituHybridizationHistochemistry，ISHH）簡稱原位雜交（InSituHybridization），屬于固相分子雜交的范疇，它是用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法。根據所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據探針的標記物是否直接被檢測，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標記的探針與靶核酸進行雜交，

DNA實驗技術：限制性內切酶消化DNA實驗2013/07/27

標簽：限制性內切酶消化DNA影響限制性內切酶反應的因素很多。DNA制品中的污染均能抑制酶切活性。這種抑制可通過增加酶作用單位數、增大反應體枳以稀釋可能的抑制劑或延長反應時間來加以克服。實驗方法單酶單DNA樣品消化消化多個DNA部分消化實驗方法原理進行限制酶切割反應只需簡單地將酶和DNA樣品放在合適的反應緩沖液溫育，其中DNA和酶的量、緩沖液的離子強度、溫育溫度和時間都依具體的反應而改變。實驗材料DNA試劑、試劑盒TE酶切緩沖液EDTA儀器、耗材電泳儀實驗步驟1.混合下列溶液于一個無菌的微量離心管

DNA實驗技術：DNA斑點和狹線印跡實驗2013/07/27

斑點和狹線印跡是一種將混合的未經分離的面定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上進行雜交分析的簡單技術。用來檢測被印跡的1DNA制品中靶序列的相對豐度。實驗方法多樣抽濾法實驗材料DNA試劑、試劑盒SSCNaClNaOHTris·Cl儀器、耗材紫外透射儀電泳儀多樣抽濾加樣器實驗步驟1.裁一張與多樣過濾加樣器一樣大小的尼龍膜，將膜置于6×SSC的表面讓其自然浸沒。放置10min。2.裁一張與多樣過濾加樣器一樣大小的Whatman3MM濾紙，用6×SSC浸濕。3.將Whatman3MM濾紙置于多樣抽濾加樣器上，將膜

DNA實驗技術：重組質粒的連接、轉化及篩選2013/07/27

*節概述質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段（＜10kb）且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段,然后體外使兩者相連接,再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。但在實際工作中,如何區分插入有外源DNA的重組質粒和無插入而自身環化的載體分子是較為困難的。通過調整連接反應中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環化限制在一定程度之下,也可以進一步采取一些特殊的克隆策略,如

DNA實驗技術：DNA的酶切實驗2013/07/27

采用粘末端連接必須對目的DNA分子和載體分子進行酶切以獲得相應的粘末端進行連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應溫度不同，這時可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切；2）先進行低鹽要求的酶酶切，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應要求，加入第二種酶進行酶切；3）使用通用緩沖液進行雙酶切。具體要根據酶的反應要求進行，盡量避免星號活力。一材料、試劑和儀器：1材料：質粒DNA

DNA實驗技術：亞硫酸氫鹽修飾后測序法檢測甲基化2013/07/27

甲基化檢測方法（亞硫酸氫鹽修飾后測序法）甲基化是目前的研究熱點，就我所做的一點工作并其中一點心得，與大家分享。希望能夠對大家有所幫助。*部分基因組DNA的提取。這一步沒有懸念，*可以購買供細胞或組織使用的DNA提取試劑盒，如果實驗室條件成熟，自己配試劑提取*可以。DNA比較穩定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應該是完整的。此步重點在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。使用兩者的細節：1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水

DNA專題：從動物肝臟中提取DNA2013/07/22

一、原理：在濃氯化鈉（1―2mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小，在稀氯化鈉（0.14mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來。將抽提得的核蛋白用SDS（十二烷基硫酸鈉）處理，DNA或（RNA）即與蛋白質分開，可用氯仿―異戊醇將蛋白質沉淀除去，而DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量乙醇，DNA即析出。為了防止DNA或（RNA）酶解，提取時加入EDT

染色質免疫共沉淀（ChIP）實驗2013/07/22

（二）、除雜及抗體哺育。8、超聲破碎結束后，10，000g4oC離心10min。去除不溶物質。留取300ul做實驗，其余保存于-80oC。300ul中，100ul加抗體做為實驗組；100ul不加抗體做為對照組；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M），65oC處理3h解交聯，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。9、在100ul的超聲破碎產物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpe

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）（圖）2013/07/22

實驗原理熒光原位雜交（FluorescenceinsituhybridizationFISH）是一門新興的分子細胞遺傳學技術，是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術。目前這項技術已經廣泛應用于動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究待許多領域。FISH的基本原理是用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DN

凝膠遷移實驗系列二-實驗操作方法2013/07/22

1.探針的標記：（1）如下設置探針標記的反應體系：待標記探針（1.75pmol/微升）2微升T4PolynucleotideKinaseBuffer（10X）1微升Nuclease-FreeWater5微升[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmolat10mCi/ml）1微升T4PolynucleotideKinase（5-10U/微升）1微升總體積10微升按照上述反應體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4PolynucleotideKinase，混勻。（2）使用水

DNA專題：大腸桿菌 細菌轉化2013/07/22

一、原理質粒DNA粘附在細菌細胞表面，經過42°C短時間的熱擊處理，促進吸收DNA.然后在非選擇培養基中培養一代，待質粒上所帶的抗菌素基因表達，就可以在含抗菌素的培養基中生長。二、器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯?，制冰機，恒溫搖床，培養皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養箱。三、試劑培養基（不加抗菌素），LB培養基（加抗菌素），無菌ddH2O,IPTG,X-gal.四、實驗準備無菌dd

DNA專題：質粒DNA的提取與純化2013/07/22

一、實驗目的與原理質粒多為一些雙鏈、環狀的DNA分子，是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質粒是進行分子生物學實驗操作，進行遺傳工程改良物種等工作時zui主要的DNA載體。提取質粒的基本步驟分為三步：①細菌的培養和質粒的擴增②細菌菌體的裂解③質粒DNA的純化本實驗采取的菌體裂解方法為堿解法，質粒純化方法為梯度離心法。二、材料與試劑1、材料：大腸桿菌2、儀器：超凈工作臺，培養箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺式離心機，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測儀3、

ATCC:食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法2013/07/15

1主題內容與適用范圍本文規定了食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法。本文適用于航空食品的檢驗。2設備和材料吸管（1ml、10ml）、恒溫培養箱（36±1℃、44.5±0.5℃）、冰箱、均質器、振蕩器、平皿、稀釋瓶、天平、顯微鏡等3培養基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、EC肉湯、伊紅美藍瓊脂（EMB）、營養瓊脂斜面、色氨酸肉湯、MR-PV培養基、Korser氏枸掾酸鹽肉湯、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液、

ATCC專題：實驗室消毒滅菌技術2013/07/15

嚴格的消毒滅菌對細胞與胚胎工程研究與應用工作極為重要，直接影響著整個實驗能否順利進行。（一）消毒滅菌方法目前常用的消毒滅菌方法多采用物理方法（如干熱滅菌法、濕熱滅菌法、過濾除菌法、射線殺菌法等）和化學方法（消毒劑、抗生素）兩大類。1．干熱滅菌法是利用恒溫干燥箱內120oC～150oC的高熱，并保持90～120分鐘，殺死細菌和芽孢，達到滅菌目的的一種方法。主要適用于不便在壓力蒸汽滅菌器中進行滅菌，且不易被高溫損壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌。用此方法滅菌的物品干燥，易于貯存。

ATCC專題：細菌凍存方法2013/07/15

實驗試劑BacteriumpreparationCryoprotectiveagentTrueCoolTMcryovial實驗設備CoolBoxTMCFT30ice-freecoolingstationCoolRack®CFT30CoolRack®CFCryolabelsand/orcryomarkersThermalTrayHPplatform（optional）CoolSinkTMBX50（optional）37°Cwaterbath-80°CFreezer實驗步驟1.BacteriaPre

ATCC專題：實驗室無菌操作2013/07/15

（一）無菌操作前的準備工作培養材料接種時的無菌操作過程除上述各項消毒滅菌操作外，還需完成以下無菌操作步驟，從而獲得接種的無菌培養材料。工作人員無菌操作前需用肥皂刷洗雙手及手臂，并用流水沖凈，并對手臂消毒后穿戴好滅菌工作服、工作帽和口罩，更換拖鞋，才能進入無菌操作區。如進入層流操作室進行實驗操作，應完成緩沖準備區內的淋浴、一次更換滅菌衣帽、拖鞋；手臂消毒、二次更換滅菌防護衣帽、手套、拖鞋等；再在風淋區進行無菌風淋后方可進入層流操作室。進入無菌操作區后，再用70%～75%的酒精擦拭雙手和前臂，完成無

ATCC專題：食品中菌落總數的測定2013/07/15

食品中菌落總數的測定，目的在于了解食品在生產中，從原料加工到成品包裝受外界污染的情況；也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態，確定食品的保存期，以便對被檢樣品進行衛生學評價時提供依據。食品有可能被多種類群的微生物所污染，每種細菌都有它一定的生理特性，培養時應用不同的營養條件及其生理條件（如溫度、培養時間、PH值、需氧性質等）去滿足其要求，才能分別將各種細菌培養出來。但在實際工作中，一般都只用一種常用的方法去作菌落總數的測定，所得結果，只包括一群能在營養瓊脂上發育的嗜中溫性需氧菌的菌落數。國

專題：細胞轉染操作方法2013/07/08

轉染，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例；化學介導方法很多，如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術；生物介導方法，有較為原始的原生質體轉染，和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率zui

專題：轉染（transfection）--轉染試劑的選擇2013/07/08

下面我們為大家提供一些常用脂質體試劑的適用細胞系信息以及轉染FAQs：1.promega公司Promega轉染試劑產品適合于人HeLa，HepG2，293，K562，Jurkat；猴COS-7，CV-1；小鼠NIH3T3；倉鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆蟲S19等等細胞系的RNAi轉染。詳情請參閱http：//www.promega.com.cn/files/cpxl/zhuanran/zhuanran.htm2.Invitrogen公司根據經驗，我公司推薦您使用Invitrogen公司生產