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流式檢測細胞樣品的制備

來源:上海北諾生物科技有限公司   2013年04月24日 15:13  

方案A:組織培養細胞的制備。
方案B:淋巴組織細胞制備。
方案C:非淋巴組織細胞制備。
方案D:全血PBMC的分離。

小貼士
1、流式細胞儀檢測需要將細胞制備成單細胞懸液。
2、避免細胞成團,以免堵塞流式細胞儀。
3、實體組織制備單細胞懸液需要物理方法分離或酶消化法進行,具體組織的方法,依照經驗來進行。


方案A: 組織培養細胞的制備

實驗材料:
Accutase™ 酶細胞分離培養基 (eBioscience Cat. No. 00-4555)
eBioscience® 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222)
15ml或50ml的離心管。

實驗流程:
1、如果是懸浮細胞,則小心將細胞移入離心管中,進行計數和活力分析。進行步驟3.
2、如果是貼壁細胞,建議使用Accutase™ 酶細胞分離培養基 (eBioscience Cat. No. 00-4555)是細胞團塊分離,制備成單細胞懸液后置于離心管中計數和活力分析。(注意:accutase 可能會改變某些細胞表位,應該預實驗觀察避免其干擾檢測)
3、300g 離心5min。棄去上清,應用適量的流式染色緩沖液重懸細胞,調整細胞濃度為2×107/ml。


方案B:淋巴組織細胞制備。

實驗材料:
60×15mm 的組織培養皿
5ml 注射器
細胞過濾器(尼龍網過濾)
eBioscience® 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222)
15ml或50ml的離心管。

實驗方案:
1、獲取組織(脾臟,淋巴結或胸腺)加入5~10ml eBioscience® 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222),使用5ml注射器注射心研磨組織(或采用兩片載玻片研磨亦可)。
2、收集磨碎的細胞懸液,過濾至離心管中計數和活力分析。
3、300g 離心5min。棄去上清,應用適量的流式染色緩沖液重懸細胞,調整細胞濃度為2×107/ml。


方案C:非淋巴組織細胞制備。

剪刀和手術刀片
剪刀和手術刀片
PBS
60×15mm 的組織培養皿
5ml 注射器
細胞過濾器(尼龍網過濾)
eBioscience® 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222)
15ml或50ml的離心管。

實驗流程:
1、獲取組織剪碎或切碎組織為2~4mm碎塊,用PBS稀釋適量的酶進行消化(溫度,方法依照酶的說明書)。
2、小心分離細胞團塊,過濾除去死細胞和碎片。
3、300g 離心5min,棄去上清。加PBS 5ml 300g 離心5min,棄去上清,重復一次。計數和活力分析。
4、300g 離心5min,棄去上清,應用適量的流式染色緩沖液重懸細胞,調整細胞濃度為2×107/ml。


方案D:全血PBMC的分離。

實驗材料:
PBS
Ficoll® 淋巴細胞分離液
eBioscience® 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222)
15ml或50ml的離心管。

實驗流程:
1、以PBS 1:1稀釋血樣。將血樣輕輕加到2ml Ficoll® 淋巴細胞分離液或其他品牌亦可。
2、1000g離心20min,小心吸取分離液和PBS之間的霧狀細胞,即為PBMC。至新的離心管中。
3、4度,300g 離心5min,棄上清。應用適量的流式染色緩沖液重懸細胞,計數和細胞活力,調整細胞濃度為2×107/ml。

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