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專題：瞬時轉染分析研究的步驟2013/07/08

1．瞬時轉染分析法目前有很多功能性分析方法用于研究轉錄調控，zui常用的方法是瞬時轉染分析法。該方法是通過一定的轉染程序將含目的調控區的質粒導人培養細胞。在典型情況下，調控區調控“報告基因”的轉錄。報告基因是在mRNA和蛋白質的水平上都易于被正確檢測到的基因。產生的質粒在培養細胞中轉錄后，在特定時刻測定從報告基因上合成的mRNA或蛋白質，以評價調控區的活性。人們將這種分析方法稱為瞬時轉染分析，因為此時質粒仍然以附加的形式存在，很少整合進宿主基因組。因此，mRNA或蛋白質產物必須在短時間內（1～3

專題：轉染實驗的注意事項2013/07/08

將制備好的siRNA，siRNA表達載體或表達框架轉導至真核細胞中的方法主要有以下幾種：1.磷酸鈣共沉淀將氯化鈣，RNA（或DNA）和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質量，因為甚至偏離*條件十分之一個pH都會導致磷酸鈣轉染的失敗。2.電穿孔法電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉導分子。將細胞懸浮液置于電場中會

專題:脂質體介導DNA轉染法2013/07/08

脂質體（lipofectinregeant,LR）試劑是陽離子脂質體N-[1-2，3-Dioleyoxy,Propyl]-n,n,n-TrimethylammoniumChloride（DOTMA）和Dioleoylphotidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1:1（w/w）]。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下zui方便的轉染方法之一。轉染率高，優于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進行轉染時，首先需優化轉染條件，應找

ELISPOT技術的應用與展望2013/06/30

ELISPOT技術的*優點已經讓它在抗原特異性T細胞免疫學研究上*。它是當今*能夠檢測到到百萬分之一陽性細胞率的檢測技術。如此高的靈敏度就連流式細胞技術（細胞內細胞因子染色）和tetramer技術也*（LetschAet.al.，2003）。此外由于淋巴細胞的凍存復蘇問題也得到了的解決，經過凍存復蘇的細胞并不喪失免疫功能（MaeckerHTet.al.，2005；KvarnstromMet.al.，2004）。這一點對臨床試驗非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣。如果試驗牽

ELIspot常見問題分析與解決辦法2013/06/30

ELISPOT技術原理和技術特點2013/06/30

ELISPOT全名為酶聯免疫斑點檢測，英文：Enzyme-linkedImmunospotAssay。它結合了細胞培養技術與酶聯免疫吸附技術（即ELISA技術），能夠在單細胞水平檢測細胞因子的分泌情況。其技術原理，一句話概括就是：用抗體捕獲培養中的細胞分泌的細胞因子，并以酶聯斑點顯色的方式將其表現出來（SedgwickJD2005）。該技術檢測細胞因子具有三大優點：其一，靈敏度高。在一百萬個陰性細胞中只要有一個分泌細胞因子的陽性細胞即可被檢測出來。這是目前為止，zui為靈敏的檢測技術，靈敏度比傳

運用流式細胞儀計數細胞應注意的問題2013/06/30

運用流式細胞儀計數細胞應注意的問題制作組織勻漿或細胞懸液，用熒光染料染色，則可以用流式細胞儀計數不同DNA含量或倍數的細胞數。例如，在睪丸組織中，精子細胞為單倍體細胞，精原細胞、Sertoli細胞、Leydig細胞和其他非生精細胞為雙倍體細胞，初級精母細胞以及處于分裂期的精原細胞和非生精細胞為四倍體細胞。因此，運用流式細胞儀測定睪丸組織各級生精細胞DNA倍體的變化，可以間接判斷不同生精細胞數目相對比例變化的趨勢。但是，利用這些結果得出結論時一定要謹慎。例如，單倍體細胞數所占百分比下降可能說明精子

流式細胞儀的工作原理2013/06/30

流式細胞儀的工作原理流式細胞儀主要由四部分組成：流動室和液流系統，激光源和光學系統，光電管和檢測系統，計算機和分析系統。四大系統共同完成信號的產生、轉換和傳輸任務。檢測時將待測細胞或微粒制成細胞懸液，進行熒光染色后加入樣品管中。以一定壓力將待測樣品壓人流動室，在高壓下磷酸緩沖液（鞘液）從鞘液管噴出，鞘液管人口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形流束（鞘流），待測細胞在鞘液包繞下單行排列，依次通過檢測區。流式細胞儀通常以激光作為發光源。經過聚焦后的光束，垂直

細胞培養小技巧---操縱時間的藝術2013/06/16

眾所周之，每次給細胞換液體的時候都需要把細胞拿出來，然而就這一拿，“學問”就在里面：我們要盡量縮短細胞在培養箱外面的時間，盡量增加細胞在zui適環境中的時間。換液流程：1.將培養基放在37度水浴鍋內，準備好廢液缸、吸管、酒精棉球，干棉球，在超凈臺上，將照相機放在顯微鏡旁邊，然后開超靜臺紫外，開培養室紫外，開培養室風機，空調。2.30min后，進培養室。3.關紫外，開超凈臺風機，酒精擦手，關水浴鍋，將水浴鍋內的培養基放在超凈臺上，用干棉球擦干，然后開蓋，準備好吸管。4.這個時候再從培養箱里將培養瓶

細胞培養之無菌技術注意事項匯總2013/06/16

簡介細胞培養的成功很大程度上取決于保護細胞免受細菌、真菌和病毒等微生物的污染。非無菌物品、培養基和試劑、帶有微生物的空氣顆粒、不干凈的培養箱和污染的工作臺面均是導致微生物污染的來源。無菌技術的作用是在環境微生物與無菌的細胞培養物之間形成一道屏障，它通過一套操作流程來降低培養物被上述污染源污染的可能。無菌技術的組成要素包括：無菌工作區域、良好的個人衛生、無菌試劑和培養基以及無菌操作。無菌工作區域zui為簡單、經濟的減少空氣顆粒和氣體揮發（例如：灰塵、芽孢、皮屑、噴嚏）污染的方法就是采用細胞培養通風

體外細胞的原代培養、傳代培養、凍存和復蘇2013/06/16

一、實驗原理細胞培養可分為原代培養和傳代培養。直接從體內獲取的組織細胞進行培養為原代培養；當原代培養的細胞增殖達到一定密度后，則需要做再培養，即將培養的細胞分散后，從一個容器以1：2或其他比率轉移到另一個或幾個容器中擴大培養，為傳代培養，傳代培養的累積次數就是細胞的代數。細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以zui大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或DMSO作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少

細胞凋亡實驗步驟及注意事項2013/06/16

一、實驗目的1、掌屋凋亡細胞的形態特征2、學會用熒光探針對細胞進行雙標記來檢測正常活細胞、凋亡細胞和壞死細胞的方法二、實驗原理細胞死亡根據其性質、起源及生物學意義區分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是細胞在一定生理條件下一系列順序發生事件的組合，是細胞遵循一定規律自己結束生命的自主控制過程。細胞凋亡具有可鑒別的形態學和生物化學特征。在形態上可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸，細胞變園，細胞膜向內皺縮、胞漿濃縮、內質網擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀

微生物 液體培養基移種技術2013/05/26

用于純種細菌的增菌及觀察細菌在液體環境中的生長特征（混濁生長，表面生長或沉淀生長）（1）材料肉湯培養基斜面培養物（大腸埃希菌、化膿性鏈球菌、枯草芽胞桿菌）（2）方法①取接種環在火焰上灼燒滅菌、冷卻。②以“雙管移植法”左手持細菌斜面培養物和肉湯培養基兩支試管，右手持接種環，按無菌操作法取少量細菌，將沾菌的接種環在斜傾的接近液面的管壁上輕輕涂抹研勻，試管直立使沾附在管壁上的細菌沒入液體中，接種后放37℃恒溫箱中培養。（3）結果①渾濁生長大腸埃希菌菌液呈均勻混濁，管底有少量沉淀。②沉淀生長化膿性鏈球菌

微生物 水體中大腸菌群的檢測2013/05/26

實驗原理所謂大腸菌群，是指在37℃培養24h內能發酵乳糖產酸、產氣的兼性厭氧的革藍氏陰性無芽孢桿菌的總稱。主要由腸桿菌科中四個屬內的細菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。水的大腸菌群數是指100mL水檢樣內含有的大腸菌群實際數值，以大腸菌群zui近似數（MPN）表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽孢桿菌等多種細菌。這些細菌都可以隨人畜排泄物進入水源，由于大腸菌群在腸道內數量多，所以，水源中大腸菌群的數量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項重要指標

微生物 細菌凍存方法2013/05/26

實驗試劑BacteriumpreparationCryoprotectiveagentTrueCoolTMcryovial實驗設備CoolBoxTMCFT30ice-freecoolingstationCoolRack®CFT30CoolRack®CFCryolabelsand/orcryomarkersThermalTrayHPplatform（optional）CoolSinkTMBX50（optional）37°Cwaterbath-80°CFreezer實驗步驟1.BacteriaPre

微生物 半固體培養基移種技術2013/05/26

用于保存菌種及間接檢查細菌有無動力。（1）材料半固體培養基。細菌斜面培養物。（2）方法①將接種針經火焰滅菌冷卻后，從斜面培養物表面沾取細菌。②用無菌法穿刺接種，將接種針刺入半固體培養基正中央，深度達距管底0.5cm處停止，然后循原路退出。注意在刺入及拔出時要保持接種針不向穿刺線外擺動。③試管口通過火焰滅菌，塞上棉塞。接種針經火焰滅菌。培養物放37℃恒溫箱中培養。（3）結果：有動力的細菌呈擴散生長，無動力的細菌沿穿刺線生長。

微生物 斜面培養基移種技術2013/05/26

（1）材料瓊脂斜面培養基經分離培養的平板培養物。（2）方法①在瓊脂斜面培養基試管上部標明移種的菌名（或編號）、接種日期、接種者的組別及代號。②左手持長有細菌的平板底，右手持接種環。接種環在火焰上滅菌冷卻后，沾取平板劃線上發育良好的孤立菌落。把平板放回原處，立即用此手取斜面培養基斜持，用右手小指與手掌夾持棉塞，輕輕轉動后撥出棉塞，管口通過火焰滅菌。③將已沾菌的接種環伸入斜面培養基的管底部的凝固水，沿斜面培養基的表面從底向上劃一直線，然后再從底部向上劃連續曲折線；也可不劃直線只劃曲折線。取出接種環，

【感受態細胞的制備】 一步法制備感受態細胞2013/05/15

一、操作步驟：1.涂平板：為取得*的感受態效率，必須先把甘油菌或其它形式保存的菌種涂LB平板，并培養過夜。2.接種：取一有新鮮培養的菌種的LB平板，后續操作均在超凈臺內進行。把鑷子的頂端在70%酒精中蘸一下，并在酒精燈上略略燒一下，使鑷子的頂端處于無菌狀態。用鑷子夾取一個無菌的塑料槍頭或牙簽，從平板上挑取一個單克隆，然后把蘸有菌種的塑料槍頭或牙簽放到裝有3毫升LB的細菌培養試管內。上述操作也可以使用接種環等進行操作。3.培養：37℃約200rpm培養過夜，通常培養時間控制在16小時左右為宜。不宜

感受態細胞的制備】 感受態細胞的制備及溶液配制2013/05/15

1.挑取適當菌株的E.coli單菌落接種于2mlSOB培養液中，37℃搖床過夜。2.取0.5-1ml過夜培養的菌液轉種到50mlSOB中，18℃劇烈震蕩，直到A600達到0.6。3.將培養物轉移到50ml離心管中，4℃4,000rpm/min離心10min。同時在冰浴上配置TB溶液。4.棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養液被吸干。5.取1ml剛配的TB溶液打散菌體沉淀，再加入15mlTB（1/3體積的起始培養液），冰浴10-15min，4℃4,000rpm/min離心10min。6.棄上清，沉

【感受態細胞的制備】 如何選擇進口高壓滅菌器2013/05/15

進口高壓滅菌器因其使用的安全性和自動化程序高，深受實驗室用戶的喜愛。那么，怎么才能買到稱心如意的產品呢？怎樣區分哪些產品是*？哪些是國內組裝產品呢？下面將告訴您如何選擇進口高壓滅菌器：在選購進口高壓滅菌器之前，首先需要了解，進口高壓滅菌器，尤其是50升以上的進口高壓滅菌器，在中國屬于特種設備，在使用前，用戶需要向當地的特種設備檢查機構（或是鍋檢所，或是技術監督局，按各地的實際情況）辦理使用許可證。在申請辦理使用許可證時，需要提交的證書包括：一、《進口壓力容器生產許可證》，簡稱壓力容器許可證。這個