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3． 當染色的時候，固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號。為了得到更好的結果，染色后應該馬上分析。
注意：流式細胞染色實驗中，所有實驗條件的優化都很重要。關鍵參數包括靶細胞、抗體效價以及動力學。
材料：12×75 mm的圓底試管（Falcon Cat.No.2008）或96孔圓底微量滴定板（Falcon Cat.No.3910），原始抗體（既未純化也未偶聯），
緩沖液： eBioscience流式染色緩沖液（Cat.No.00-4222），流式鞘液
半個小時細胞準備，半個小時抗體稀釋和樣品準備，半個小時到一個小時孵育過程，半個小時以上的運行和分析時間
1． 采集組織（脾，淋巴結，胸腺），用注射器的活塞擠壓以制成單細胞懸液，此過程用10ml的染色緩沖液；
2． 轉移到50ml的圓錐形試管中并使大塊沉淀到試管底部或者通過尼龍濾網過濾，得到單細胞懸液；
3． 4℃ 離心沉淀細胞懸液4-5分鐘（300-400g），棄掉上清；
4． 如果上過程采集的脾，還用用RBC裂解，否則進入下一步；
6． 再次離心細胞，棄掉上清，重懸細胞使其細胞數達到2×107 個/ml；
1． 用50 ?l染色液稀釋前面選的抗體，分裝到每個試管或微量滴定板的孔中。吸取50 ?l染色液到陰性對照試管中。在滴定實驗中，滴定范圍是2-0.03?g/百萬個細胞；
2． 加入50 ?l細胞懸液（相當于106個細胞）于每個試管或孔中，輕輕混勻；
3． 避光冰浴20分鐘。注意：某些抗體可能需要更長的孵育時間，用預實驗摸索實驗條件；
4． 孵育之后，加入染色液（試管2ml，微量滴定板200?l）；
5． 4℃ 離心沉淀細胞5分鐘（300-400g），吸掉上清；
a.如果用熒光標記的抗體，用500 ?l染色液重懸已染色的細胞沉淀物，然后在流式細胞儀上分析。
注意：如果同時加入多種熒光標記的抗體進行染色，孵育和洗滌的步驟和上面的一樣。注意加入熒光抗體后的所有步驟都要在低溫避光的條件下進行。
12×75 mm的試管（Falcon Cat.No.2008）
eBioscience 流式染色液（Cat.No.00-4222）
eBioscience 1×RBC Lysis Buffer（Cat.No.00-4333）
流式儀試驗時間半個小時抗體稀釋和樣品準備半個小時到一個小時染色過程半個小時以上的運行和分析時間方法
1． 用50?l染色液稀釋未偶聯或偶聯生物素的抗體，分裝到每個試管中。分裝50?l染色液到干凈的或陰性對照試管中。滴定ioscience抗人的偶聯熒光素的抗體20?l于每個樣品中；
3． 避光室溫孵育15-30分鐘。注意：某些抗體結合力較低可能需要更長的孵育時間。預試驗摸索這些條件。
4． 加2ml 1×RBC（預溫到室溫）于每個試管中，輕輕混勻；
5． 避光室溫孵育樣品10分鐘。用1×RBC 孵育不要超過15分鐘。
6． 室溫離心樣品（300-400g），抽吸掉上清液，然后用2ml 染色液洗一次。
a. .如果用熒光標記的抗體，用500 ?l染色液重懸已染色的細胞沉淀物，然后在流式細胞儀上分析。
注意：如果同時加入多種熒光標記的抗體進行染色，孵育和洗滌的步驟和上面的一樣。注意加入熒光抗體后的所有步驟都要在低溫避光的條件下進行。
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