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流式胞內染色實驗方法

來源：上海北諾生物科技有限公司   2013年04月24日 17:28  

方案A：兩步法胞內（細胞質）蛋白染色。
方案B：一步法胞內蛋白染色（細胞核）。

注意：
1、不同細胞因子的刺激條件是不同的，比如：LPS刺激活化單核細胞分泌IL-6的培養時間一般是6個小時，而檢測IL-10則需要刺激24小時。
2、結合熒光的流式抗體應在4度，避光儲存。
3、使用抗體前請低速離心30秒，使貼壁抗體沉底。不建議斡旋混勻抗體，可用手指輕彈混勻。
4、除非方案中注明，默認的抗體孵育方法是冰上或4度避光。
5、緩沖液中加BSA或FBS可以減少固定破膜后的非特異性背景。


方案A: 兩步法胞內（細胞質）蛋白染色

實驗材料：
12×75mm 圓底檢測流式管。
[可選]可固定的活度染料eFluor® 450 （eBioscience Cat. No. 65-0863）, eFluor® 660 （eBioscience Cat. No. 65-0864），eFluor® 780 （eBioscience Cat. No. 65-0865）。
胞內抗原的直標抗體。
IC Fixation Buffer （eBioscience Cat. No. 00-8222）。
Permeabilization Buffer （10X） （eBioscience Cat. No. 00-8333）雙蒸水稀釋成1×。
Flow Cytometry Staining Buffer （eBioscience Cat. No. 00-4222）（可以自己配置）。

實驗流程：
1、按照流式樣品要求制備單細胞懸液。
2、按照流式表面染色方法標記CD3和CD4。緩沖液洗滌一次，離心*棄上清。斡旋分散細胞。
3、加100ul IC Fixation buffer ，斡旋固定細胞。室溫避光孵育20min。
4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
5、300g 室溫離心5min,棄上清。
6、2ml 1×permeabilization buffer重懸細胞。
7、300g 室溫離心5min,棄上清。
8、加100ul 1×permeabilization buffer 重懸細胞后，加入二抗IL-17A （或其他胞內抗原抗體），室溫避光孵育20min。
9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室溫離心5min,棄上清。
10、加2ml 流式染色液，300g 室溫離心5min,棄上清。
11、適量流式染色液重懸即可上機檢測。同行對照依照上述步驟進行。軟件分析結果。


方案B：一步法胞內（細胞核）蛋白染色

實驗材料：
12×75mm 圓底檢測流式管。
[可選]可固定的活度染料eFluor® 450 （eBioscience Cat. No. 65-0863）, eFluor® 660 （eBioscience Cat. No. 65-0864），eFluor® 780 （eBioscience Cat. No. 65-0865）。
胞內抗原的直標抗體。
Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent （eBioscience Cat. No.00-5521）
Permeabilization Buffer （10X） （eBioscience Cat. No. 00-8333）雙蒸水稀釋成1×。
Flow Cytometry Staining Buffer （eBioscience Cat. No. 00-4222）（可以自己配置）。

注意：
Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1份加3份 Diluent 稀釋為工作液（1:4稀釋）。

實驗方案：
1、按照流式樣品要求制備單細胞懸液。
2、按照流式表面染色方法標記CD3和CD4。緩沖液洗滌一次，離心*棄上清。斡旋分散細胞。
3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定細胞。室溫或四度避光孵育30-60min（小鼠樣品zui長可以四度固定18小時）。
4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
5、300g 室溫離心5min,棄上清。
6、2ml 1×permeabilization buffer重懸細胞。
7、300g 室溫離心5min,棄上清。
8、加100ul 1×permeabilization buffer 重懸細胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞內抗原抗體），室溫避光孵育20min。
9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室溫離心5min,棄上清。
10、加2ml 流式染色液，300g 室溫離心5min,棄上清。
11、適量流式染色液重懸，即可上機檢測。同行對照依照上述步驟進行。軟件分析結果。

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