PCR技術代替了為測序而反復進行的分子克隆和模板制備步驟。PCR技術與自動測 序技術相結合后，它將成為一種zui快、zui有效的測定核苷權序列的方法。本章主要綜 述各種測模板的制備以及如何完成PCR產物的直接測序。與傳統的將PCR片段克隆入質 粒或病毒基因組相比，直接序列分析有兩個主要的優點:1)由于它是一個不依賴于生 物體(如細菌、病毒等)的體外系統，因而它更容易標準化(即例于自化2);對于每個待 測樣品，只需測定一個單鏈序列，因而它也就更快和更準確。相比之下，間接測序為 了區別在PCR反應過程中由dna聚合酶引入的隨機錯朽核苷酸所引起的原始基因組序列 中的突變，以及由體外重組而產生的人工擴增產物，如產生鑲嵌等位基因(混合克隆) 等，每個樣品不得不測定幾個PCR產物克隆的序列。
不需借助在細菌中克隆就可直接獲得清蜥和準確的序列結果，其難易程度取決 于:1)只擴增靶序列的PCR引物的擴增能力(通常稱為PCR特異性);2用以獲笪測序模板 的方法。與引物物異性及模板制備有關的問題將在下面談到。雖然DNA測序的化學法 (Maxam-Gilbrt)可以用來直接測序，但我們這里僅討論Sanger的末端終止法。

*的PCR條件

PCR反應的特異性在很大程度上是由寡聚核苷酸引物的序列所決定的。對于特定 的引物組，PCR的特異性可以由于采用*的反應條件、退火溫度和PCR緩沖液中的 MgCl2濃度而發生明顯的變化。如果用標準的1.5mM的MgCl2濃度不能得到所需的特異 性PCR產物，我們建議MgCl2的終濃度為1.4∽2.5mM之間，以0.2mM增長率來改變MgCl2 濃度，以選擇*Mg++濃度。一個較常遇見的問題是，使PCR特異性達到zui高的MgCl2 濃度導致pcr擴增失敗(dropouts)。這可能是由于模板DNA溶液中有較高的EDTA，它隆 低了提供給Taq DNA聚合酶MgCl2量。因此，對于擴增溶解在TE(1mM EDTA)中的DNA， 我們建議用含2.0mM的MgCl2的PCR緩沖液。

pcr反應的溫度范圍包含有三個不同的恒定期:變性期、退火期和延伸期，還有它 們之間的過渡期。為了獲得用于序列分析的模板或雜交探針的單鏈DNA，通常并不需 要改變參數。

凝膠純化PCR擴增的靶序列

如果*PCR反應條件不能產生所需的特異性產物，可采用新的寡核苷酸重新進 行擴增，或用凝膠電泳來分離不同的PCR產物，而后再各自重新擴增進行序列分析。 長度不同的片段可以用瓊脂糖凝膠電泳來分離:

1.片段大小在80-100bp時，可采用3%NuSieve1%普通瓊脂糖或用聚丙烯酰胺膠來 分離。

2.從膠上切下含所南非PCR片段的薄片。

3.加入50∽100μlTE浸泡膠片，可反復凍融或放置幾個小時使DNA從膠中擴散出 來。

4.取少量(1-5%)進行第二次擴增，為得到純凈單一的產物，用于第二次PCR擴增 的凝膠抽提物的量必須少于1ng。

5.現已發現瓊脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物質。因而，如需重新擴增供Tab聚合 酶測序用的片段，用丙烯酰胺電泳分離。

當用PCR引物擴增幾個同樣長度的相關序列時，如來自幾個新近復制的基因，或 重復序列或保守的信號序列(conserved signal sequences)的同樣顯子，可以通過下 列兩種不同方法來改進電泳分離。1).先用只切割某一模板的內切酶進行酶切，而后 電泳純化完整的PCR產物。2).用可使核苷酸序列不同的擴增產物分開的電泳系統。下 一個部份將討論此類系統中的變性甲酰胺梯度凝膠系統。采用方法一時，必須事先了 解在不同PCR產物中的內切酶位點。