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組織和細胞總RNA提取(TRIzol法)

來源:上海士鋒生物科技有限公司   2016年05月09日 07:58  

TRIzol RNA 提取試劑盒是由 GIBCO BRL 公司推出提取 RNA 的產品,其操作方便、快捷。 

(一)試劑準備 
1 . TRIzol 試劑。 
2 .氯仿 
3 .異丙醇 
4 . 75% 乙醇( DEPC H2O 配制) 
5 . DEPC H2O 

(二)操作步驟 
1 . 樣品處理: 
(1)培養細胞:收獲細胞 1-5×10 7 ,移入 1.5ml 離心管中,加入 1ml Trizol ,混勻,室溫靜置 5min 。 
(2)組織:取 50-100mg 組織(新鮮或 -70 ℃ 及液氮中保存的組織均可)置 1.5ml 離心管中,加入 1ml Trizol 充分勻漿,室溫靜置5 min 。 
2 .加入 0.2ml 氯仿,振蕩 15s ,靜置 2min 。 
3 . 4 ℃ 離心, 12000g × 15min ,取上清。 
4 .加入 0.5ml 異丙醇,將管中液體輕輕混勻,室溫靜置 10min 。 
5 . 4 ℃ 離心, 12000g × 10min ,棄上清。 
6 .加入 1ml 75% 乙醇,輕輕洗滌沉淀。 4 ℃ , 7500g × 5min ,棄上清。 
7. 晾干,加入適量的 DEPC H 2 O 溶解( 65 ℃ 促溶 10-15min )。 

(三)注意事項 
1 .樣品量和 Trizol 的加入量一定要按步驟( 1 )的比例,不能隨意增加樣品量或減少 Trizol 量,否則會使內源性 RNAse 的抑制不*,導致 RNA 降解。 
2 .實驗過程必須嚴格防止 RNsae 的污染。 

二、總 RNA 定量 
RNA 定量方法與 DNA 定量相似。 RNA 在 260nm 波長處有zui大的吸收峰。因此,可以用 260nm 波長分光測定 RNA 濃度, OD 值為 1 相當于大約 40 μ g/ml 的單鏈 RNA 。如用 1cm 光徑,用 ddH 2 O 稀釋 DNA 樣品 n 倍并以 ddH 2 O 為空白對照,根據此時讀出的 OD 260 值即可計算出樣品稀釋前的濃度: 
RNA ( mg/ml ) =40 × OD 260 讀數×稀釋倍數 (n)/1000 
RNA 純品的 OD 260 /OD 280 的比值為 2.0 ,故根據 OD 260 /OD 280 的比值可以估計 RNA 的純度。若比值較低,說明有殘余蛋白質存在;比值太高,則提示 RNA 有降解。

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