三、操作步驟

（一）取材、冰凍切片：

將動物以3%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（見圖2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）。將組織塊入30%蔗糖/0.1M PBS液（4℃），1-2天后冰凍切片，將切片裱貼于原位雜交玻片上，切片厚度為15-20μm。

（二）探針制備與檢測（定量）：

1.  隨機引物制備cDNA核酸探針以DIG DNA 標記檢測試劑盒為例：

（1）探針制備：

①模板DNA（0.5-3 μg） 15 μl，100℃變性10 min，冰浴5 min。

②在冰浴中加：Hexanucleotide mix 2 μl， dNTPmix 2 μl，Klenow Enzyme 1 μl，反應總體積為20 μl。37℃孵育過。

③在上述20 μl 的標記產物中加4 M LiCl 2.5 μl，75 μl（無水乙醇預冷，輕輕混勻，-20℃放置 2 hr。4℃離心12 000 g×15 min，棄上清。70%乙醇（預冷） 50 μl 洗滌，7 500 g×5 min，棄上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解沉淀，-20℃保存備用。

（2）探針敏感性檢測：

①樣品稀釋：取dig-標記探針1 μl 用ddH₂O以1：10、1：100、1：1000、1：1000、1：10000梯度稀釋。

②取一張與點樣器大小相近的尼龍膜，標記方向，ddH₂O中浸泡 1 min，6×SSC中浸泡10 min，置點樣器上，負壓抽吸5 min。

③將上述樣品點于尼龍膜上，繼續抽吸10 min。

④取下尼龍膜，置紫外燈下10 cm 處照射5 min，晾干。

⑤將膜置于適量預雜交液（5-10 ml）中，37℃預雜交10 min。

⑥加入Anti-dig 抗體（1：5000），37℃雜交30 min。

⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室溫洗10 min×2次。

⑧顯色：15 ml TSM2中加300 μl 顯色液（NBT/BCIP），37℃避光顯色30 min。

2.  PCR法制備cDNA核酸探針：

（1） 探針制備：

以PCR DIG Probe Synthesis Kit 為例：

在0.5 ml 離心管中，依次加入：

PCR引物 1（10 pM） 2 μl；

PCR引物 1（10 pM） 2 μl；

質粒DNA 模板（10-100 pg） 2 μl；

PCR DIG mix 2 μl （含dNTP和DIG-11-dUTP）；

dNTPmix 2 μl；

10×PCR buffer 5 μl；

Taq 酶（2 u/μl） 1 μl；

加入適量ddH₂O，使總體積達50 μl。

① 將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。
一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 45 s → 58℃ 45 s → 72℃ 60 s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7 min。

② 在上述PCR產物中加入4 M LiCl 12.5 μl、預冷無水乙醇375 μl，輕輕混合后置于-20℃2 h，12 000g×15 min，棄上清。70%乙醇（預冷） 120 μl 洗滌沉淀，離心7500g×5 min，棄上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解，-20℃保存備用。

（2）探針檢測：

行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察DIG-DNA探針含量（采用目測法）。

（三）原位雜交反應（以DIG-cDNA探針為例）：

1.  0.1 M PBS （pH 7.2） 浸 5-10 min。

2.  0.1 M甘氨酸/0.1 M PBS 浸5 min。

3.  0.3%TritonX-100/0.1 M PBS 浸10-15 min。

4.  0.1 M PBS 洗 5 min×3次，加蛋白酶K（1 μg/ml），37℃孵育30 min。

5.  4%多聚甲醛浸5 min。

6.  0.1 M PBS 洗 5 min×2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1 M 三乙醇胺中10 min。

7.  預雜交：滴加適量預雜交液，42℃ 30 min。

（1）雜交：傾去預雜交液，在每張切片上滴加10-20 μl 雜交液（將探針變性后稀釋在預雜交液中，0.5 ng/μl ），覆以蓋玻片或蠟膜，42℃ 過。

（2）洗片：

4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20 min；

0.2×SSC 37℃洗10 min；0.2×SSC與0.1 M PBS各半洗10 min；

0.05 M PBS 洗 5 min×2次。

10.  3% BSA/0.05 M PBS 包被，37℃ 30 min。

11.  滴加抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復合物（以抗體稀釋液1:5000稀釋）4℃孵育過。

12.  0.05M PBS洗15 min×4次；TSM1 10 min×2次； 新鮮配制TSM2 10 min×2次。

13.  顯色：在玻片上滴加適量顯色液，4℃避光過。

14.  將玻片置于TE中10-30 min以終止反應。酒精梯度脫水、二甲苯脫脂，中性樹膠封片。

15.  顯微鏡下觀察結果。

四、注意事項：

1.  作為DNA-RNA的雜交，需防RNase的污染。

2.  cDNA探針在雜交時必須變性解鏈。具體方法是：將探針置100℃加熱5 min，冰浴驟冷