1 主題內容與適用范圍

本文規定了食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法。

本文適用于航空食品的檢驗。

2 設備和材料

吸管（1ml、10ml）、恒溫培養箱（36±1℃、44.5±0.5℃）、冰箱、均質器、振蕩器、平皿、稀釋瓶、天平、顯微鏡等

3 培養基和試劑

月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、EC肉湯、伊紅美藍瓊脂（EMB）、營養瓊脂斜面、色氨酸肉湯、MR-PV培養基、Korser氏枸掾酸鹽肉湯、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液、生理鹽水、革蘭氏染色液、Kovacs氏靛基質試劑、甲基紅指示劑、Voges-proskauer（V-P）試劑、

4 樣品制備

4.1 以無菌操作取有代表性的樣品盛于滅菌容器內。如有包裝，則用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。

4.2 制備樣品勻液

以無菌操作取25g樣品，放入裝有225ml稀釋劑的滅菌均質杯內，于8000r/min均質1-2min，制成1：10的樣品勻液。如樣品均質時間超過2min，應在均質杯外加冰水冷卻。

4.3 稀釋樣品勻液

用10ml滅菌吸管準確吸取1：10的樣品勻液10ml，放入裝有90ml稀釋劑的150ml稀釋瓶中。迅速振搖，將樣品混勻，制成1：100的樣品勻液。

5 大腸菌群的測定

5.1 大腸菌群MPN值的測定

5.1.1 對每個樣品，選擇適宜的三個連續稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯，每管接種1ml。

5.1.2 將接種管置于36±1℃的培養48±2h。

5.1.3 觀察試管的產氣情況：檢查倒管內是否有氣泡產生，記錄在24h和48h內產氣的LST肉湯管數。如所有LST肉湯管均未產氣，則可報告為大腸菌群陰性；如有產氣者，則進一步作證實試驗。

5.2 大腸菌群的證實試驗

5.2.1 將所有產氣管用直徑為3mm的接種環移種到煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中。

5.2.2 置BGLB肉湯管于36±1℃的培養48±2h。

5.2.3 記錄所有BGLB肉湯管的產氣管數。

5.2.4 結果報告：按BGLB肉湯產氣管數，查MPN表報告每克（毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。

6 糞大腸菌群測定

6.1 用接種環將所有48±2h內產氣的LST肉湯管培養物移種于EC肉湯管中。

6.2 將所有接種的EC肉湯管在30min內放入44.5±0.5℃水浴箱內，培養24±2h。水浴箱的水平面應高于肉湯培養基液面。應以已知為44.5℃產氣陽性的大腸桿菌和44.5℃不產氣的產氣腸桿菌或其他大腸菌群細菌作陽性和陰性對照。

6.3 記錄EC肉湯管的產氣情況。產氣管為糞大腸菌群試驗陽性；不產氣管為糞大腸菌群試驗陰性。

6.4 結果報告：按產氣管數，查MPN表報告每克（毫升）樣品中糞大腸菌群的MPN值。

7 大腸桿菌測定

7.1 將6.3條中的EC肉湯管繼續培養24h取其產氣管的培養物劃線接種于伊紅美藍（EMB）平板，36±1℃的培養24±2h。

7.2 檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。

7.3 如有典型菌落，則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落，則從每個平板上至少挑取2個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營養瓊脂斜面上，36±1℃的培養18-24h。

7.4 將斜面培養物移種到下列培養基進行生化試驗。

7.4.1 色氨酸肉湯：在36±1℃的培養24±2h后，加Kovacs氏試劑0.2-0.3ml，上層出現紅色為靛基質陽性反應。

7.4.2 MR-VP培養基：在36±1℃的培養48±2h后。以無菌操作移取培養物1ml至13mm*100mm試管中，加5%萘酚乙醇溶液0.6ml，40%氫氧化鉀溶液0.2ml和少許肌酸結晶，振搖試管后靜置2h，如出現伊紅色，為VP試驗陽性。

將 MR-VP培養物的剩余部分再培養48h滴加5滴甲基紅溶液。如培養物變紅色，為甲基紅試驗陽性，若變黃色則為陰性反應。

7.4.3 Korser氏枸掾酸鹽肉湯：于36±1℃的培養96h記錄有無生長。

7.4.4 LST肉湯：于36±1℃的培養48±2h，觀察試管中是否產氣。

7.4.5 革蘭氏染色：取18h營養瓊脂斜面培養物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。

7.4.6 大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下

如出現上表以外的生化反應類型，表明培養物可能不純，應重新劃線分離，必要時做重復試驗。

7.5 結果報告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，發酵乳糖產酸產氣，IMViC試驗為++--或-+--，再根據LST肉湯陽性管數查MPN表，報告每克（毫升）樣品中大腸桿菌MPN值。

注：本文參照SN0169-92《出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》