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感受態專題：感受態細胞的制備及溶液配制2013/11/11

實驗試劑LB培養基，KB培養基，10%甘油，液氮，0.1MCaC12溶液實驗設備超凈工作臺，搖床，離心機，250mL離心瓶，0.5mL的離心管實驗材料大腸桿菌，農桿菌和假單胞桿菌實驗步驟1.電擊感受態細胞的制備1）-80℃保存的大腸桿菌，農桿菌或者假單胞桿菌在固體平板上（DH，BL21在LB平板上，GV3101在LB/Gen;P.s.pv.tomato0288-9和P.syringaepv.tabaci6505在KB平板上）劃線。2）接種單克隆于5-10mL液體培養基，37℃（大腸桿菌）或者28

感受態專題：真核細胞的轉染實驗步驟2013/11/11

1.在6孔板中接種1~3×105細胞/孔，加入2ml*培養基，置CO2孵箱中37℃培養過。2.待細胞長到50-80%單層時，在無菌離心管中配制如下溶液：i.溶液A：將4?g待轉染的超純DNA稀釋到250?l無血清培養基中，靜置5minii.溶液B：將2-25?lLipofectAMINE稀釋到250?l無血清培養基中，靜置5min3.混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置15-45min。4.用2ml無血清培養基輕輕洗滌細胞，加入0.8ml無血清培養基/孔，將脂質體復合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置

感受態專題：轉化克隆的篩選和鑒定2013/11/11

1．目的學會用酶切法或PCR法篩選重組質粒轉化成功的克隆菌。2．原理利用轉化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質粒上帶有外源基因插入片斷的克隆菌落。3．器材旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯票鶛C，恒溫搖床，超凈工作臺，酒精燈，無菌牙簽，搖菌管。4．試劑LB培養基（加抗菌素），PCR用試劑，引物，質粒提取用試劑，酶切需要的限制性內且酶及其緩沖液，65%甘油（65%甘油，0

感受態專題：細胞瞬時轉染2013/11/06

原理：通過脂質體介導轉染法及電穿孔等基因轉染技術，將靶基因導入細胞，一般在轉染后48小時左右，靶基因即可在細胞內表達。根據不同的實驗目的，48小時后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。應用：觀察目的基因及其表達蛋白在某種細胞中的功能（短時間即可進行觀察，但效應會很快丟失）。一般流程：1）細胞接種：轉染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉染當天細胞密度應達到60%~80%覆蓋。2）細胞轉染（脂質體、電穿孔、FuGENE6等）3）48小時以后鑒定目的基因的表達情

感受態專題：電轉化流程2013/11/06

一、電轉化感受態細胞的制備1.用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10mlLB液體培養基的50ml離心管中。（同時做培養基和槍頭的空白對照）2.37℃，220rpm，培養14-16個小時。3.第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000mlLB液體培養基中，37度，220rpm，振搖2-3小時，每半小時測一次OD，當OD值達到0.3-0.4時，停止培養。4.將菌液在冰上預冷30分鐘，隨后將菌液分裝到500ml預冷的離心杯中，4℃，2500rpm離心10分鐘。5.棄上清，離心杯中加入少量ddH

感受態專題：電穿孔轉化感受態E.coli TG1細胞的制備2013/11/06

材料和試劑1.恒溫旋轉式搖床2.三角燒瓶（容量為1或2L）3.50ml滅菌離心管4.低溫高速離心機5.SB培養基細菌培養用胰化蛋白胨20g細菌培養用酵母提取物5gNaCl0.5g去離子水950ml250mmol/LKCl溶液10ml以5N的NaOH調節溶液的pH值至7.0，加去離子水至1L，高壓蒸氣滅菌。6.20%葡萄糖溶液7.1mol/LMgCl2溶液8.10%甘油操作步驟1.從新鮮的LB平板培養物中挑選一個TG1克隆，接種于10m1SB培養基中。2.37℃搖床培養過。3.取2.5ml培養物轉

感受態專題：磷酸鈣法轉染HEK293T細胞2013/11/06

一.試劑配制無菌水ddw：高溫滅菌；分裝；2XHBS：280mMNaCl10mMKCl1.5mMNa2HPO412mMglucose50mMHEPESAdjustthepH,every0.05pHfrom7.00to7.45using10NNaOH,thenaddddw.tothefinalvolume.過濾滅菌，分裝；2MCaCl2：過濾滅菌，分裝。二.實驗過程：1.鋪細胞：選擇狀態良好的293T細胞傳代，2-3x105個細胞/35mmdish。2.20-24h后，待細胞長至鋪滿瓶底約50-7

專題：原核表達（原理、材料與實驗方案）2013/11/06

一、原理1、E.coli表達系統E.coli是重要的原核表達體系。在重組基因轉化入E.coli菌株以后，通過溫度的控制，誘導其在宿主菌內表達目的蛋白質，將表達樣品進行SDS-PAGE以檢測表達蛋白質。2、外源基因的誘導表達提高外源基因表達水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達分成兩個階段，以減輕宿主菌的負荷。常用的有溫度誘導和藥物誘導。本實驗采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導外源基因表達。不同的表達質粒表達方法并不*相同，因啟動子不同，誘導表達要根據具體情況而定。二

感受態制備：農桿菌感受態細胞制備實驗2013/10/30

農桿菌感受態細胞制備實驗標簽：農桿菌感受態細胞制備植物轉基因農桿菌感受態細胞制備可以：（1）用于建立農桿菌轉化體系；（2）用于農桿菌表達系統構建；（3）用于農桿菌其他分子生物學研究。實驗方法氯化鈣法電轉農桿菌感受態實驗方法原理在基因工程操作中，感受態細胞的制備和質粒的轉化是一項基本技術。感受態是細菌細胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態。農桿菌的感受態可用CaCl2處理而誘導產生。將正在生長的農桿菌細胞加入到低滲的CaCl2溶液中，0℃下處理便會使細菌細胞膜的透性發生改變，此時的細胞呈現

感受態制備：農桿菌感受態的制備和轉化2013/10/30

雙元載體的農桿菌轉化1.1農桿菌感受態細胞的制備1.1.1.取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml鏈霉素平板劃線，28℃培養。1.1.2.挑取單菌落接種于5mlYM液體培養基中，220rpm28℃振蕩培養12-16hr。1.1.3.取2ml菌液轉接于100mlYM液體培養基中，28℃220rpm振蕩培養至OD600=0.5。1.1.4.轉入無菌離心管，5000rpm離心5min,去上清液。1.1.5.加入10ml預冷的0.1M的CaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置20min。4℃500

感受態制備：酵母感受態細胞制備實驗2013/10/30

標簽：酵母感受態細胞制備酵母感受態細胞制備可以：（1）用于建立酵母轉化體系；（2）用于酵母表達系統構建；（3）用于酵母其他分子生物學研究。實驗方法化學法試劑盒制備法實驗材料釀酒酵母試劑、試劑盒YPDA液體培養基蒸餾水甘油二甲基亞砜儀器、耗材培養皿離心機離心管冰箱實驗步驟一、試劑與耗材1.試劑細菌用-酵母提取物（Fisher）、細菌用-蛋白胨（Fisher）、葡萄糖（Fisher）、細菌用-瓊脂粉、去離子水、甘油（Sigma）、二甲基亞砜（Sigma）、聚乙二醇3350（Sigma）、醋酸鋰（Si

感受態制備：枯草芽孢桿菌感受態細胞的制備實驗2013/10/30

標簽：枯草芽孢桿菌感受態細胞制備枯草芽孢桿菌感受態細胞的制備可以：（1）用于建立枯草芽孢桿菌轉化體系；（2）用于其基因改造；（3）用于提高枯草芽孢桿菌生產性能相關研究。實驗方法化學法化學改進法實驗材料枯草芽孢桿菌168試劑、試劑盒SPI培養基EGTASPII培養基檸檬酸鈉EGTA氫氧化鈉KH2PO4K2HPO4MgCl2MgSO4葡萄糖酵母膏（NH4）2SO4儀器、耗材培養箱培養皿錐形瓶紫外分光光度計接種環離心管實驗步驟一、試劑配制1.SP鹽0.2%（NH4）2SO4，1.4%K2HPO4，0.

細胞轉染：脂質體轉染的幾個實驗方法2013/10/30

摘要：本實驗介紹了脂質體轉染的幾個方法。實驗原理脂質體（LR）試劑是陽離子脂質體DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下zui方面的轉染方法之一。轉染率高，優于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進行轉染時，首先需要優化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做。先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1-5ug和孵育時間6h，開始，

細胞轉染實驗2013/10/30

一、實驗目的學習和掌握外源基因導入真核細胞的主要方法——脂質體介導的轉染。了解外源基因進入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達（綠色熒光蛋白），為染色準備實驗材料。二、實驗原理上圖所示是脂質體介導轉染的示意圖，它顯示了外源質粒進入細胞的一般過程。外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質體介導法和病毒介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入；磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染

感受態制備：大腸桿菌感受態細胞的制備、重組DNA的轉化、克隆篩選2013/10/30

1.實驗目的和要求通過本實驗學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態細胞和外源質粒DNA轉入受體菌細胞的技術以及篩選轉化體的技術。了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。2.相關知識及原理感受態細胞（Competentcells）：受體細胞經過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態細胞（competentcell）。轉化（transformation）：是將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的

RNA實驗技術：核糖核酸酶保護分析2013/10/22

一、體外轉錄在無菌1.5ml微型離心管中，結合以下內容：4ul5倍轉錄緩沖液2ul0.1MDTT4ul2.5MMNTP（A，C，G）0.8ulRNA酶抑制劑（25U/ul）RNA酶抑制劑（Promega）中100UM冷UTP1ul/ugUL線性DNA模板5ul10UCI/ULP32UTP（800Ci/mmol）1ulRNA聚合酶SP6，T7或T3總體積?20ul。孵育1小時，37℃。2ul每個轉錄的DNA酶I，孵育20分鐘，37℃。二、探頭凈化凈化探頭使用QIAGEN公司的QIAquick核苷酸

RNA實驗技術：細胞質RNA提取實驗2013/10/22

標簽：細胞質RNA由于RNA的種類來源很多，因而提取制備方法各異，一般有苯酚法，去污劑法和鹽酸胍法，其中苯酚法實驗室zui常用。組織勻漿后用苯酚處理離心，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，向水相加冷乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法較好除去DNA和蛋白質，且獲得生物活性的RNA。實驗方法基本方案實驗材料RNA試劑、試劑盒PBS細胞裂解液SDS蛋白酶K酚氯仿異戊醇無水乙醇儀器、耗材離心機培養箱實驗步驟1.對于單層培奍細胞（1）每10cm培養皿培養的細胞，用冰冷PBS洗滌3次。（2）每次1ml

RNA實驗技術：Northern blot實驗2013/10/22

標簽：NorthernblotNorthernblot是一種通過檢測RNA的表達水平來檢測基因表達的方法，通過northernblot的方法可以檢測到細胞在生長發育特定階段或者脅迫或病理環境下特定基因表達情況。Northernblot首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據其分子量大小加以區分，然后通過與特定基因互補配對的探針雜交來檢測目的片段。實驗方法Northernblot技術NorthernBlot實驗方法原理Northernblot的基本概述是將RNA樣品通過變性瓊脂糖凝膠電泳進行分離，

RNA實驗技術：RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳實驗原理、材料和操作步驟2013/10/22

一、實驗目的學習RNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術。二、實驗原理RNA可以使用非變性或變性凝膠電泳進行檢測。在非變性電泳中，可以分離混合物中不同分子量的RNA分子，凡是無法確定分子量。只有在變性情況下，RNA分子*伸展，其泳動率才與分子量成正比。判斷RNA提取物的完整性是進行電泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的電泳圖譜應可清晰看到18srRNA、28srRNA、5srRNA的三條帶，且28srRNA的亮度應為18srRNA的兩倍。三、材料、試劑及器具1、材料總RNA提取物。2、試劑（1）0

RNA實驗技術：RNAi實驗原理與方法選擇2013/10/12

一、RNAi的分子機制通過生化和遺傳學研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應階段（inititationａndeffectorsteps）。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段（smallinterferingRNAs,siRNAs）。證據表明；一個稱為Dicer的酶，是RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNA