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蛋白質技術專題：血清蛋白瓊脂糖凝膠電泳2013/12/11

【原理】瓊脂糖（agarose）是經過挑選，以質地較純的瓊脂（agar）作為原料而制成的。瓊脂在化學上是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復合物。瓊脂膠是一含有硫酸根和羥基的多糖，它具有離子交換性質，這種性質會給電泳及凝膠過濾以不良的影響。瓊脂糖是直鏈多糖，它由D－半乳糖和3,6－脫水－L－半乳糖的殘基交替排列組成。瓊脂糖主要通過氫鍵而形成凝膠。電泳時因凝膠含水量大（98－99%），近似自由電泳，因為固體支持物的影響少，故電泳速度快，區帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團，電滲影響很少，是一種較好的電泳材

蛋白質技術專題：血漿游離血紅蛋白測定2013/12/05

實驗原理血紅蛋白具有類過氧化物酶活性，可催化H2O2釋放新生態氧，使鄰甲聯苯胺氧化發生顏色變化，由無色zui終變為藍紫色。根據顯色深淺與標準進行比較，可測出其含量。實驗方法材料：1．2g/L鄰甲聯苯胺溶液2．1%H2O23．10%醋酸溶液4．分光光度計方法：1.抽取靜脈血2-3ml，枸櫞酸鈉抗凝，離心分離血漿。2．按下表進行操作，用分光光度計，波長為530nm，以空白管調零，測定測定管的吸光度。試劑（ml）測定管空白管2g/L鄰甲聯苯胺溶液0.50.5患者血漿0.02/1%H2O20.50.5混

蛋白質技術專題：血紅蛋白電泳（hemoglobin electrophoresis）2013/12/05

實驗原理血紅蛋白電泳（hemoglobinelectrophoresis）目的是檢出和確認各種正常和異常的血紅蛋白。根據不同的血紅蛋白帶有不同的電荷，等電點不同，在一定的pH緩沖液中，血紅蛋白的等電點小于緩沖液的pH時帶負電荷，電泳時在電場中向陽極泳動，反之，Hb帶正電荷向陰極泳動。在一定電壓下，經過一定時間的電泳，不同的血紅蛋白所帶電荷不同，分子量不同，其泳動方向和速度不同，可分離出各自的區帶，同時對電泳出的各區帶進行比色或電泳掃描，可進行各種血紅蛋白的定量分析。一般zui常用的是pH8.6醋

蛋白質技術專題：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測外源蛋白的表達2013/12/05

[實驗原理]SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中zui經常使用的一種方法。它是將蛋白樣品同離子型去垢劑十二烷基硫酸鈉（SDS）以及巰基乙醇一起加熱，使蛋白變性，多肽鏈內部的和肽鏈之間的二硫鍵被還原，肽鏈被打開。打開的肽鏈靠疏水作用與SDS結合而帶負電荷，電泳時在電場作用下，肽鏈在凝膠中向正極遷移。不同的大小的肽鏈由于在遷移時受到的阻力不同，在遷移過程中逐漸分開，其相對遷移率與分子量的對數間成線形關系。pGLO是將綠色熒光蛋白（GFP）的基因克隆在阿拉伯糖啟動子之后的一種表達

蛋白質技術專題：聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定IgG純度2013/12/05

（一）原理由于聚丙烯酰胺凝膠的濃度可以按要求配制，因此可以形成“連續系統”和“不連續系統”兩種電泳系統。“不連續系統”zui大的特點在于大大提高了樣品分離的分辨率。這種電泳的主要特點是：（1）使用兩種不同濃度的凝膠系統；（2）配制兩種凝膠的緩沖溶液成分及pH不同，并且與電泳槽中電泳緩沖液的成分、pH也不相同。在實驗中，電泳凝膠分為兩層：上層膠為低濃度的大孔膠，稱為濃縮膠或成層膠，配制此層膠的緩沖液是Tris-HCl，pH6.7；下層膠則是高濃度的小孔膠，稱為分離膠或電泳膠，成膠的緩沖液是Tris

蛋白質技術專題：蛋白質抽取2013/12/05

蛋白質在細菌中表現后，以反復的冷凍-解凍方法打破細胞，再用硫酸銨把蛋白質沉淀下來，此步驟可以去除大部份核酸、多醣、脂質等雜物。儀器用具：恒溫震蕩培養箱37℃；高速冷凍離心機及離心管（使用20,000rpm離心陀）使用高速離心機要注意：離心機及離心陀的溫度要預冷*，相對位置的兩只離心管要平衡好，離心陀轉速不能超過zui高速限；液態氮及冰筒；37℃溫水浴藥品試劑：轉型菌株pQG11/M15[pREP]單一菌落；LB/amp/kan及IPTG（1Mstock）；Lysisbuffer（50mMNa3P

蛋白質技術專題：folin—酚試劑法（lowry法）測蛋白質含量2013/12/05

一、實驗原理這種蛋白質測定法是zui靈敏的方法之一。過去此法是應用zui廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，

蛋白質技術專題：PPO粗酶液的純化2013/12/03

一、原理1.葡聚糖凝膠SephadexG-200凝膠柱層析利用大分子不能進入凝膠顆粒內部zui先流出柱外，而小分子物質進入凝膠顆粒內部，流速慢而zui后流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質分離開。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質）2.利用離子交換法，選取DEAE-陰離子纖維素DE52柱材料，因為PPO是帶有陽離子的蛋白質，在層析時會吸附在柱材料上，而雜蛋白會洗下。后用NaCl梯度洗脫PPO，（NaCl為強離子交換劑，能將弱吸附在柱材料上的PPO置換下來）。粗酶液從而得到

蛋白質技術專題：蛋白質測序2013/12/03

一、概念當前，所謂蛋白質測序，主要指的是蛋白質的一級結構的測定。蛋白質的一級結構（Primarystructure）包括組成蛋白質的多肽鏈數目。很多場合多肽和蛋白質可以等同使用。多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質生物功能的基礎。蛋白質氨基酸順序的測定是蛋白質化學研究的基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來，現在已經知道約十萬個不同蛋白質的一級結構。二、測定步驟1多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，如，血

蛋白質技術專題：免疫球蛋白提取技術2013/12/03

免疫球蛋白（ImmunoglobulinIg）的含量代表著機體體液免疫的水平，并進一步代表著B細胞的功能，因此測定血清Ig含量可以推知機體的體液免疫功能和診斷某些疾病引起的Ig的過高和過低。隨著免疫學的發展和需要，免疫球蛋白的純化和其成分的提純成為*的手段。純化的方法很多，有單一法，但大多數采用二步法以上相結合的方法，特別是以硫酸銨提純為基礎，再經過層析柱的方法來提高免疫球蛋白及其各成分的純度zui為常用。硫酸銨溶液能使蛋白質膠體脫水并中和其電荷而使之沉淀下來（稱為鹽析）。不同濃度的硫酸銨鹽析蛋

蛋白質技術專題：蛋白質的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗2013/12/03

[原理]蛋白質在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開，形成按1.4gSDS/1g蛋白質比例的SDS-蛋白質多肽復合物，該復合物帶負電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移，且主要由于凝膠的分子篩作用，遷移速率與蛋白質的分子量大小有關，因此可以濃縮和分離蛋白質多肽。聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質多數采用一種不連續的緩沖系統，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液，其pH值和離子強度也相應不同，故電泳時，樣品中的SDS-多肽復合物沿移動的界面移

蛋白質技術專題：蛋白質純化膠體過濾法2013/12/03

不同大小的蛋白質分子進入膠體過濾管柱，可依其分子量差異分離；是一種廣泛應用的partition色析法（Pharmacia操作手冊，GelFiltration）。儀器設備：色析管柱（PharmaciaCcolumn,1.6×100cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（fractioncollector,需準備干凈試管約100支）；濃縮用離心機（低速5,000rpm）；濃縮用離心管Centriprep-30（Amicon4322）請注意其使用方法藥品試劑：膠體SephacrylS-300（Phar

蛋白質技術專題：液相色譜之反相液相色譜2013/11/27

反相色譜（reversedphascchromatography,RPC）是基于溶質、極性流動相和非極性固定相表面間的疏水效應建立的一種色譜模式，任何一種有機分子的結構中都有非極性的疏水部分，這部分越大，一般保留值越高，在液相色譜中這是應用面zui廣的一種分離模式，在生物大分子的反相液相色譜條件下，流動相多采用酸性的、低離子強度的水溶液，并加一定比例的能與水互溶的異丙醇、乙腈或甲醇等有機改性劑，大量使用的填料為孔徑在30納米以上的硅膠烷基鍵合相，除此之外，也有少量高聚物微球。實驗表明，烷基鏈長對

蛋白質技術專題：蛋白標準品（Marker）知識匯總2013/11/27

相關專題蛋白Marker可分為：一、未預染的Marker即寬分子量蛋白標準、高分子量蛋白標準以及低分子量蛋白標準;二、預染的Marker即單色預染和多色預染。在westernblot過程中，分子量Marker就像個螺絲釘一樣沒雖然是個小細節，然而就是這樣一個小細節對實驗結果有著不可忽視的作用。這個WesternBlot參照家族的一員的作用主要是用來指示蛋白條帶所對應的分子量大小，只有標準量無誤了，實驗結果才有說服力，除此之外，蛋白標準還有表示轉移成功或者蛋白在凝膠上的電泳程度等等的作用，所以選擇

蛋白質技術專題：重組DNA技術與基因工程（組圖）2013/11/27

重組DNA技術是現代分子生物技術發展中zui重要的成就之一。即是基因工程（GeneEngineering）的核心技術。重組DNA技術（RecombinantDNATechnique）是人類根據需要選擇目的基因（DNA段）在體外與基因運載體重組，轉移至另一細胞或生物體內，以達到改良和創造新的物種和治療人類疾病的目的。這一技術的發展和應用，關鍵在于限制酶的發現和應用。一、限制酶限制性內切核酸酶（restrictiveendonucleases），又稱限制酶。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶

蛋白質技術專題：凝膠層析法脫鹽和分離蛋白質2013/11/27

（一）原理凡鹽析所獲得的粗制蛋白質（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類，這類將影響以后的純化，所以純化前均應除去，此過程稱為“脫鹽”（desalthing）。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法，這兩種方法各有利弊。前者的優點是透析后析品終體積較小，但所需時間較長，且鹽不易除盡；凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時間也短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以，要根據具體情況選擇使用。前實驗中樣品體積較小，凝膠達濾后樣品體積不會太增加，所以選用凝膠過濾法。（二）試劑與器材（1）SephadexG-25。（2）0.

蛋白質技術專題：蛋白質凝膠電泳凝膠的制備2013/11/27

【材料與試劑】（1）30%的丙烯酰胺：分別稱取29g丙烯酰胺，1gN,N-亞甲雙丙烯酰胺加溫熱的去離子水60ml，加熱至37℃溶解，補加水至終體積為100ml,過濾，即配成30%（w/v）丙烯酰胺貯存溶液。丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過程中緩慢轉變為丙烯酸和雙丙烯酸，這一脫氨基反應是光催化或堿催化，故溶液的pH值不超過7.0，應置于棕色瓶中4℃保存。（2）10%十二烷基硫酸鈉（SDS）：稱取10gSDS加去離子水90ml加熱至68℃，加幾滴濃鹽酸調節至pH7.2加水至100ml，即為10%（w/v

蛋白質技術專題：雙向電泳操作步驟2013/11/27

水化上樣（被動上樣）1.從冰箱中取出IPG膠條，室溫放置10min。2.沿水化盤槽的邊緣從左向右線性加入樣品，槽兩端各1cm左右不加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產生氣泡，否則會影響膠條中蛋白質的分布。3.用鑷子輕輕撕去IPG膠條上的保護層。注意：堿性端較脆弱，應小心操作。4.將IPG膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品溶液上。注意：不要將樣品溶液弄到膠條背面，因為這些溶液不會被膠條吸收；還使膠條下面的溶液產生氣泡。如產生了氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕走。5.

蛋白質技術專題：免疫共沉淀（Co-IP）詳細步驟教程2013/11/25

一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。目前多用精制的proreinA預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的pror

蛋白質技術專題：蛋白質的表達、分離和純化2013/11/25

目的要求（1）了解克隆基因表達的方法和意義。（2）了解重組蛋白親和層析分離純化的方法。實驗原理克隆基因在細胞中表達對理論研究和實驗應用都具有重要的意義。通過表達能探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理，同時克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作結構與功能的研究。大腸桿菌是目前應用zui廣泛的蛋白質表達系統，其表達外源基因產物的水平遠高于其它基因表達系統，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的80%。本實驗中，攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BL21中，在37℃，IPTG誘導下，超量表達攜帶有