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細(xì)胞技術(shù)專題：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)2014/02/18: 標(biāo)簽：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)可以：（1）用于細(xì)胞保種；（2）用于分子生物學(xué)研究；（3）用于基因治療研究。實(shí)驗(yàn)方法腹腔取材法實(shí)驗(yàn)方法原理巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長(zhǎng)期生存。巨噬細(xì)胞也建有無限細(xì)胞系，大多來自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能，易

細(xì)胞技術(shù)專題：細(xì)胞自噬的研究方法2014/02/13: 正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)，經(jīng)報(bào)道的工具藥有：一、自噬誘導(dǎo)劑(1)BredeldinA/Thapsigargin/Tunicamycin：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(2)Carbamazepine/L-690，330/LithiumChloride（氯化鋰）：IMPase抑制劑（即Inositolmonophosphatase，肌醇單磷酸酶）(3)Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓(4)N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：C

細(xì)胞技術(shù)專題：細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)2014/02/13: 一、原理培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。用臺(tái)盼蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力。二、儀器

細(xì)胞技術(shù)專題：新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)2014/02/13: 標(biāo)簽：新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)可以：（1）細(xì)胞保種；（2）用于細(xì)胞形態(tài)研究；（3）應(yīng)用于臨床研究。實(shí)驗(yàn)方法胰酶消化法實(shí)驗(yàn)方法原理將大鼠的心肌細(xì)胞從機(jī)體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。實(shí)驗(yàn)材料SD乳鼠試劑、試劑盒低糖DMEM、胰酶EDTA青鏈霉素碳酸氫鈉液新生牛血清谷氨酰胺D-Hank's液新潔爾滅碘酒酒精儀器、耗材鋁盒眼科直剪眼科彎剪眼科直鑷眼科彎剪玻璃培養(yǎng)皿廣口瓶棉球燒杯錐形瓶離心管磁力攪拌器攪

細(xì)胞技術(shù)專題：PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路2014/02/13: 目的：通過特異性阻斷PI3K和mTOR，觀察HepG2和Hep3B細(xì)胞株P(guān)I3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活性及生物學(xué)行為的改變，探討相關(guān)的分子機(jī)制。方法：在培養(yǎng)的HepG2、Hep3B人肝癌細(xì)胞株和人正常肝細(xì)胞株QSG-7701上，以免疫印跡方法（Westernblot）檢測(cè)各細(xì)胞株中PI3K（p110α亞單位）、PTEN、pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表達(dá)情況；分別用PI3K抑制劑LY294002（50μmol/ml）和mTOR抑制劑Rapamycin（RAPA

細(xì)胞技術(shù)專題：細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)2014/02/13: 標(biāo)簽：細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞原代培養(yǎng)可以：（1）為研究生物體細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、繁殖提供有力的手段；（2）為傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件；（3）服務(wù)于臨床實(shí)踐，用于藥物篩選等。實(shí)驗(yàn)方法胰酶消化法組織塊直接培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)方法原理將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際

細(xì)胞技術(shù)專題：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)2014/02/13: 標(biāo)簽：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)原代培養(yǎng)可以：（1）用于細(xì)胞保種；（2）用于分子生物學(xué)研究；（3）用于基因治療相關(guān)研究。實(shí)驗(yàn)方法胰酶消化法1胰酶消化法2實(shí)驗(yàn)方法原理將小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）從機(jī)體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細(xì)胞，置MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。實(shí)驗(yàn)材料孕鼠試劑、試劑盒PBSEDTA胰酶MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基FBS高糖DMEM儀器、耗材眼科直剪眼科直鑷眼科彎鑷玻璃平皿3尼龍濾網(wǎng)離心管手術(shù)刀片實(shí)驗(yàn)步驟一、實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞技術(shù)專題：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：PI單染色法2014/02/10: 一、基本原理其原理主要是根據(jù)細(xì)胞凋亡時(shí)在細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變。這些改變包括細(xì)胞核的改變、細(xì)胞器的改變、細(xì)胞膜成分的改變和細(xì)胞形態(tài)的改變等，其中細(xì)胞核的改變特征性，主要包括以下幾個(gè)方面：1、細(xì)胞核的改變由于凋亡細(xì)胞核的改變，造成各種染色體熒光染料對(duì)凋亡細(xì)胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對(duì)經(jīng)固定的凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，其DNA可染性降低。許多學(xué)者把這種DNA可染性的降低認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一。2、光散射特性凋亡細(xì)胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細(xì)胞

細(xì)胞技術(shù)專題：體外細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇2014/02/10: 一、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從體內(nèi)獲取的組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)為原代培養(yǎng)；當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要做再培養(yǎng)，即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后，從一個(gè)容器以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，為傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù)。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以zui大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或DMSO作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少

細(xì)胞技術(shù)專題：細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)2014/02/10: 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌屋凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征2、學(xué)會(huì)用熒光探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記來檢測(cè)正常活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的方法二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個(gè)體和生存中起著非常重要的作用。它是細(xì)胞在一定生理?xiàng)l件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細(xì)胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。細(xì)胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。在形態(tài)上可見凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離接觸，細(xì)胞變園，細(xì)胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞核固縮破裂呈團(tuán)塊狀

生物化學(xué)技術(shù)專題：對(duì)乙酰氨基酚片溶出度測(cè)定2014/02/10: 一、試驗(yàn)?zāi)康?．掌握片劑溶出度的測(cè)定方法2．能正確使用溶出度測(cè)定儀二、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)片劑等固體制劑服用后，在胃腸道中要先經(jīng)過崩解和溶出兩個(gè)過程，然后才能透過生物膜吸收。對(duì)于許多藥物來說，其吸收量通常與該藥物從劑型中溶出的量成正比。對(duì)難溶性藥物而言，溶出是其主要過程，故崩解時(shí)限往往不能作為判斷難溶性藥物制劑吸收程度的指標(biāo)。溶解度小于0.1～1.0(g/L)的藥物，體內(nèi)吸收常受其溶出速度的影響。溶出速度除與藥物的晶型、顆粒大小有關(guān)外，還與制劑的生產(chǎn)工藝、輔料、貯存條件等有關(guān)。為了有效地控制固體制劑質(zhì)量，除

生物化學(xué)技術(shù)專題：鞣質(zhì)類化合物的鑒別2014/02/10: 1．檢品溶液的制備：取五倍子（含可水解鞣質(zhì)），兒茶（含縮合鞣質(zhì)），沒食子酸（鞣質(zhì)水解產(chǎn)生偽鞣質(zhì)）少量（約0.1克）分別置大試管中，加蒸餾水約10ml，加熱煮沸，過濾，濾液作以下試驗(yàn)：2．鞣質(zhì)的一般反應(yīng)（鞣質(zhì)與偽鞣技的區(qū)別鑒定）（1）感觀試驗(yàn)：取制備的鞣質(zhì)和偽鞣質(zhì)溶液，嘗其味，并以石蕊試紙檢查溶液是否呈酸性反應(yīng)。（2）三氯化鐵反應(yīng)：取制備的鞣質(zhì)溶液（五倍子溶液或兒茶溶液）及偽鞣溶液（食子酸溶液）各1~2ml，分別加入三氯化鐵試液,鞣質(zhì)產(chǎn)生綠色或蘭黑色反應(yīng)或沉淀;偽鞣質(zhì)產(chǎn)生蘭色反應(yīng)。（3）沉淀蛋白反

生物化學(xué)技術(shù)專題：揮發(fā)油的定性鑒別2014/01/14: 1．外觀性狀：（1）取各種揮發(fā)油（松節(jié)油、薄荷油、丁香油、陳皮油及桂皮油）觀察其色澤，是否有特殊香氣，及辛辣燒灼味感。（2）揮發(fā)性：取濾紙屑一小塊，滴加薄荷油一滴，放置2小時(shí)或微熱后觀察濾紙上有無清晰的油跡（與菜油作對(duì)照實(shí)驗(yàn)）。（3）pH檢查：（檢游離酸或酚類）。取樣品一滴加乙醇5滴，以預(yù)先用蒸餾水濕潤(rùn)的廣泛pH試紙進(jìn)行檢查，如顯酸性，示有游離的酸或酚類化合物，剩下的樣品乙醇液供下面（7）（8）試驗(yàn)用。（4）FeCl3反應(yīng)（檢酚類）：取樣品一滴，溶于1ml乙醇中，加入1%得FeCL3醇液1~2滴

生物化學(xué)技術(shù)專題：皂苷的鑒別2014/01/14: 1．檢品溶液的制備：1）取皂角碎塊1g于大試管（或小燒杯）中，加蒸餾水15ml，于30~90°水浴上浸漬15分鐘后過濾，濾液供鑒別用。2）取薯蕷碎塊0.5g加上法同樣制備得薯蕷水浸液。3）取薯蕷碎塊0.5g于大試管或小錐形瓶中加95%乙醇10ml于水浴上溫浸15分鐘，濾液供鑒別。2．鑒別試驗(yàn)：（1）溶血試驗(yàn)：取濾紙片一小塊，于小心處滴加皂角浸液一滴，待干后于同處再滴加一滴，如是反復(fù)操作至滴加數(shù)滴，干燥后無噴霧血球試液（取牛血、羊血或兔血一份，用玻棒或棉簽攪和，除去凝集的血蛋白，加pH7.4磷酸鹽

生物化學(xué)技術(shù)專題：強(qiáng)心苷的鑒別2014/01/14: 1．檢品溶液的制備：取夾竹桃葉碎塊粉末3g，于100ml錐形瓶中加70%乙醇40ml，水浴上浸煮5分鐘，放冷，過濾，濾液（或經(jīng)處理后--方法參照注二）供鑒別用。[注1]：強(qiáng)心苷的試驗(yàn)都是在較強(qiáng)的堿性條件下進(jìn)行，如果樣品中含有蒽醌，也具有紅色反應(yīng)，防礙檢查，因此在檢查前需先檢查有無蒽醌類成分，若有則應(yīng)先將其除去，即將乙醇浸液在水浴上蒸發(fā)，殘?jiān)覥HCl3熱溶后過濾，CHCl3液用1%NaOH液振搖，去除蒽醌后，CHCl3液供鑒別用。[注2]：夾竹桃葉或毛地黃葉綠素，常使醇提液帶較深的綠色，影響反應(yīng)

生物化學(xué)技術(shù)專題：蒽苷的鑒別2014/01/14: 1．檢品溶液的制備：取大黃粉末2克，加乙醇20ml，在沸水浴上回流浸提10分鐘，過濾供鑒別用。2．鑒別試驗(yàn)：（1）與堿成鹽顯色反應(yīng)（Borntrager反應(yīng)）：取1ml乙醇提取液，加入1ml10%NaOH溶液，如產(chǎn)生紅色反應(yīng)，加入少量30%過氧化氫液，加熱后紅色不褪，加酸使呈酸性時(shí)，則紅色消褪再堿化又出現(xiàn)紅色。注：或取大黃粉末少許，置小試管中，加水1~2ml，加濃H2SO42-3滴，置水浴中加熱10分鐘，冷卻，加乙1-2ml振搖。用吸管吸取醚液（黃色）于另一潔凈試管中，加入NaOH試液1ml振搖

生物化學(xué)技術(shù)專題：秦皮中七葉苷、七葉內(nèi)酯的提取、分離和鑒定2014/01/09: 秦皮為本樨科白蠟樹屬植物白蠟樹（FraxinusChinensisPoxb）或苦瀝白蠟樹（F.rhynchophyllaHance）或小葉白蠟樹（F.bungeanaDC）的樹皮,味苦，性微寒。具有清熱、燥濕、收澀作用。主治溫?zé)崃〖病⒛砍嗄[瘤等癥。秦皮中含有多種內(nèi)酯類成分及皂苷、鞣質(zhì)等，其中主要有七葉苷、七葉內(nèi)酯、秦皮苷及秦皮素等。多有抗菌消炎的生理活性，七葉內(nèi)酯對(duì)細(xì)菌性痢疾、急性腸炎有較好治療效果，兼有退熱作用，毒付作用小，幾無苦味。適于小兒服用。秦皮中主要成分的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)1．七葉苷（escu

生物化學(xué)技術(shù)專題：薯蕷皂苷元的提取和鑒別2014/01/09: 目的要求：1．掌握甾體皂苷元（親脂性和中性成分）的提取方法。2．熟悉薯蕷皂苷元的性質(zhì)及鑒定法。簡(jiǎn)介：薯蕷皂苷元（Diosgenin）是一種甾體皂苷元，分子式（C27H42O31）,分子量414.61，為白色結(jié)晶，mp204～207℃，[]25D-129.3（CHCl3），溶于一般有機(jī)溶劑和醋酸，不溶于水。目前，是制造多種甾體藥物如口服避孕藥（I號(hào)，II號(hào)避孕藥片）和甾體激素（如可的松）等的重要原料。在植物界主要分布在薯蕷科薯蕷屬（Dioscorea）植物中，我國(guó)的薯蕷屬植物有80余種，其中只有薯

生物化學(xué)技術(shù)專題：巴馬汀提取及延胡索素制備的方法2014/01/09: 巴馬汀為季銨生物堿，溶于水和極性大的有機(jī)溶劑（如甲醇、乙醇等）所以可用甲醇、乙醇或水進(jìn)行提取。然后通過鹽析，降低其在水中的溶解度而沉淀，與其它雜質(zhì)分離。巴馬汀是有機(jī)堿，盡管它帶正電荷，但和水的親和力仍小于NaCl，NaCl和水的強(qiáng)親和力，降低了巴馬汀在水中的溶解度，使它被“擠”出。1．流程2．工藝（1）提取：黃藤粗粉20g，用95%EtOH回流提取2次，每次1小時(shí)，乙醇用量為100ml，合并二次醇提取液，濃縮至3~4ml，用吸管轉(zhuǎn)移到5ml小錐形瓶中，放置，析晶，抽濾得巴馬汀粗晶。（2）分離：將

生物化學(xué)技術(shù)專題：大黃中蒽醌類成分的提取分離和鑒定2014/01/09: 概述大黃記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》等許多文獻(xiàn)中，用于泄下、健胃、清熱、解毒等。自古以來，大黃在植物性瀉下藥中占有重要位置，是一位很早就被各國(guó)藥典所收載的世界性生藥。大黃的種類繁多，大黃是蓼科植物掌葉大黃（RheumpalmatclmL），大黃（R.officinaleBaill）及唐古特大黃（R.tangutiumMaxim.etRegll）的根莖及根，大黃中含有多種游離的羥基蒽醌類化合物以及它們與糖所形成的苷。已經(jīng)知道的羥基蒽醌主要有下列五種：大黃中蒽醌苷元，其結(jié)構(gòu)不同，因而酸性強(qiáng)弱也不同。大黃酸連

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