水化上樣（ 被動上樣）

1. 從冰箱中取出 IPG 膠條，室溫放置 10min。

2. 沿水化盤槽的邊緣從左向右線性加入樣品，槽兩端各 1cm 左右不加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產生氣泡，否則會影響膠條中蛋白質的分布。

3. 用鑷子輕輕撕去 IPG 膠條上的保護層。注意：堿性端較脆弱，應小心操作。

4. 將IPG膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品溶液上。注意：不要將樣品溶液弄到膠條背面，因為這些溶液不會被膠條吸收； 還使膠條下面的溶液產生氣泡。如產 生了氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕走。

5. 放置 30~45min 大部分樣品被膠條吸收，沿著膠條緩慢加入礦物油，每根膠條 約 3ml（17cmIPG），防止膠條水化過程中液體蒸發。

6. 置等電聚焦儀于- 20℃水化 11~15h。

*向 等電聚焦

1. 將紙電極置于聚焦盤的正負極上，加 ddH₂O 5~8μl 潤濕。

2. 取出水化好的膠條，提起一端將礦物油瀝干，膠面朝下，將其置于剛好潤濕 的濾紙片上雜交以去除表面上的不溶物。

3. 將 IPG 膠條膠面朝下置于聚焦盤中，膠條的正極（標有+）對應于聚焦盤的正 極，確保膠條與電極緊密接觸。

4. 在每根膠條上覆蓋 2- 3ml 礦物油。

5. 對好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序。

6. 聚焦結束的膠條，立即進行平衡、第二向 SDS-PAGE電泳。或將膠條置于樣 品水化盤中，- 20℃冰箱保存，電泳前取出膠條， 室溫放置10 分鐘，使其溶解。

第二向 SDS-PAGE電泳

1. 配制 12%的丙烯酰胺凝膠。

2. 待凝膠凝固后， 倒去分離膠表面的MilliQ水、 乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ 水沖洗。

3. 配制膠條平衡緩沖液 I

4. 在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另 一份厚濾紙用 MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸 干膠條上的礦物油及多余樣品，這樣可以減少凝膠染色時出現的縱條紋。

5. 將膠條轉移至樣品水化盤中，加入 6ml（17cmIPG）平衡緩沖液 I ，在水平搖床 上緩慢搖晃 15 分鐘。

6. 配制膠條平衡緩沖液 II 。

7. *次平衡結束后，取出膠條將之豎在濾紙上瀝去多余的液體，放入平衡緩 沖液 II 中，繼續在水平搖床上緩慢搖晃 15 分鐘。

8. 用濾紙吸去 SDS-PAGE膠上方玻璃板間多余的液體，將二向凝膠放在桌面上， 凝膠的頂部面對自己。

9. 將瓊脂糖封膠液加熱溶解。

10. 在 100ml 量筒中加入 TGS 電泳緩沖液。

11. 第二次平衡結束后，取出膠條，用濾紙吸去多余的平衡液（將膠條豎在濾紙 上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面） 。

12. 用鑷子夾住膠條的一端使膠面*浸末在 1×電泳緩沖液中漂洗數次。

13. 將膠條背面朝向玻璃板，輕輕放在長玻板上，加入低熔點瓊脂糖封膠液。

14. 用適當厚度的膠片，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面*接 觸。注意：不要在膠條下方產生氣泡， 應推動凝膠背面的支撐膜， 不要碰到面膠。

15. 放置 5 分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液凝固。

16. 打開二向電泳制冷儀，調溫度為 15℃。

17. 將凝膠轉移至電泳槽中，加入電泳緩沖液，接通電源，起始時用的低電流（5mA~10mA/gel/17cm） ，待樣品在*走出IPG 膠條，濃縮成一條線后，再加大電流 （20-30mA/gel/17cm） 待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。

18. 電泳結束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號（戴手套，防 止污染膠面） 。

19. 進行染色。