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蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot ）2013/11/25: 標(biāo)簽：western-blot免疫印跡蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）可以：（1）從蛋白質(zhì)混合物中檢出目標(biāo)蛋白質(zhì)；（2）定量或定性確定細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；（3）用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用后續(xù)分析。實(shí)驗(yàn)方法底物化學(xué)發(fā)光ECL法Western印跡法圖解實(shí)驗(yàn)方法原理Western免疫印跡（WesternBlot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體

PCR技術(shù)專題：差示反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)2013/11/25: 標(biāo)簽：差示反轉(zhuǎn)錄PCR差示反轉(zhuǎn)錄PCR也稱為mRNA差異顯示技術(shù)，它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、靈敏、RNA用量少、效率高、可同時(shí)檢測(cè)兩種或兩種以上經(jīng)不同處理或處于不同發(fā)育階段的樣品，該方法自問世以來已被廣泛用于差異表達(dá)基因的克隆鑒定研究中。實(shí)驗(yàn)方法mRNA差異顯示法熒光標(biāo)記法實(shí)驗(yàn)方法原理幾乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都帶有一個(gè)多聚的腺苷酸結(jié)構(gòu)，即通常所說的poly（A）尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA為

PCR技術(shù)專題：PCR-SSP分析實(shí)驗(yàn)原理和步驟2013/11/25: [實(shí)驗(yàn)原理]根據(jù)決定某等位基因的堿基性質(zhì)，設(shè)計(jì)3′端*個(gè)堿基分別與各等位基因的特異性堿基相匹配的序列特異性引物，在PCR反應(yīng)過程中，只有引物3′端*個(gè)堿基與決定特定等位基因的堿基互補(bǔ)時(shí)才能實(shí)現(xiàn)DNA片段的*復(fù)制，根據(jù)PCR產(chǎn)物的有無進(jìn)行等位基因的分型。[實(shí)驗(yàn)器材]PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽。[實(shí)驗(yàn)試劑]引物1：5′-GCATCAAGTACCACTGGT-3′；引物2：5′-GCATTAAGTACCACTGAG-3′；共通引物：5′-GAGAAGTTGAGAAAGGGGT-3′。模板DNA、Ta

PCR技術(shù)專題：間接原位PCR（原位雜交PCR）2013/11/25: 與直接原位PCR所不同的是，靶基因在擴(kuò)增時(shí)不進(jìn)行標(biāo)記基團(tuán)的摻入，而是標(biāo)記一段與擴(kuò)增片段互補(bǔ)的探針，在擴(kuò)增結(jié)束后，應(yīng)用此探針進(jìn)行原位雜交。因此，此處主要介紹原位雜交，其余方法同原位PCR。一、預(yù)雜交1.試劑與配制2×SSC50%去離子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v）預(yù)雜交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脫脂奶粉2.操作方法①在進(jìn)行完原位PCR擴(kuò)增后，用2×SSC預(yù)浸經(jīng)乙醇脫水、空氣干燥的玻片，并簡(jiǎn)洗15min；②用50%去離子甲酰胺37℃孵育15min；③加預(yù)雜交液20μl

PCR技術(shù)專題：免疫PCR系列三-基本實(shí)驗(yàn)步驟2013/11/25: 主要程序（1）抗原+生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復(fù)合物；（2）加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復(fù)合物；（3）加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA；（4）PCR擴(kuò)增生物素化DNA部分。實(shí)驗(yàn)步驟（1）制備生物素化DNA將噬粒BLuescriptskt,用生物素標(biāo)記的M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備出含T3和T7引物序列的280bpDNa段，即為生物素化DNA。（2）免疫PCR模式1.試劑包被緩沖液：20mmol/LTris-HCI（pH9.5），含150mmol/LNaC

PCR技術(shù)專題：PCR擴(kuò)增分離目的DNA段實(shí)驗(yàn)原理、材料和步驟2013/11/25: 一、目的了解多聚合酶鏈反應(yīng)DNA擴(kuò)增技術(shù)的基本原理和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，掌握PCR反應(yīng)基本技術(shù)。二、原理PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是1986年由KallisMullis發(fā)現(xiàn)。這項(xiàng)技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，它不僅可用于基因分離克隆和核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病診斷，腫瘤機(jī)制探查，法醫(yī)鑒定等方面。PCR技術(shù)已成為方法學(xué)上的一次革命，它必將大大推動(dòng)分子生物學(xué)各學(xué)科的研究發(fā)展。PCR是一種

PCR技術(shù)專題：PCR產(chǎn)物的克隆2013/11/25: PCR產(chǎn)物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。平頭連接是將制備好的平頭載體和補(bǔ)平或削平的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行連接。載體可用EcoRV或SmaI切成平頭；PCR產(chǎn)物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR產(chǎn)物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfuDNA聚合酶或NewEnglandBiolabs公司的VentDNA聚合酶，這兩種酶有5’→3’校對(duì)能力，擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物已經(jīng)是平頭，可以

PCR技術(shù)專題：反向PCR （inverse-PCR）實(shí)驗(yàn)步驟2013/11/20: inverse-PCR是克隆插入片段側(cè)翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假陽(yáng)性太多，而Inverse-PCR一般只要有特異條帶，基本上就是目的片段。基本步驟如下：1、反向PCR（InversePCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼DNA序列非常有效的方法。a.選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。并在T-DNA的邊界（左邊界、右邊界均可）和酶切位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物P1、P2；b.回收DNA，T4連接酶連接，使酶切后的DNA段環(huán)化；c.回收連接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就

PCR技術(shù)專題：菌落PCR2013/11/20: 菌落PCR標(biāo)簽：菌落PCR菌落PCR（ColonyPCR）可不必提取基因組DNA，不必酶切鑒定，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，省時(shí)少力。建議使用載體上的通用引物。通常利用此方法進(jìn)行重組體的篩選或者DNA測(cè)序分析。zui后的PCR產(chǎn)物大小是載體通用引物之間的插入片斷大小。實(shí)驗(yàn)方法基本方案實(shí)驗(yàn)方法原理直接挑取菌落進(jìn)行PCR，PCR的95℃加熱可以破胞，釋放基因組DNA或質(zhì)粒，成為PCR體系的模板，然后進(jìn)行鏈?zhǔn)綌U(kuò)增。實(shí)驗(yàn)材料基因樣品試劑、試劑盒dNTPPCR混合液儀器、耗材PC

PCR技術(shù)專題：巢式PCR2013/11/20: 巢式PCR標(biāo)簽：巢式PCR巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。*對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對(duì)引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)?次PCR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在*次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于*次擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)方法基本方案實(shí)驗(yàn)方法原理由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性（因?yàn)榕c兩套引物都互補(bǔ)的引物很少）增加了檢測(cè)的敏感性；又有兩對(duì)PCR引物與檢測(cè)模板的配對(duì)，增加了檢測(cè)的可靠性。由于第二套引

PCR技術(shù)專題：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析2013/11/20: 本實(shí)驗(yàn)將應(yīng)用RFLP分析技術(shù)檢測(cè)NMDA受體中的GRIN2A亞基基因3號(hào)內(nèi)含子中的2個(gè)SNP位點(diǎn)rs17750303（A→C）和rs837690（A→G）。[實(shí)驗(yàn)原理]DNA限制性內(nèi)切酶具有識(shí)別特定的DNA序列并在特定的部位切斷DNA雙鏈的活性功能，DNA分子由于突變（核苷酸的置換、插入或缺失）改變（或形成）了限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，使DNA限制性內(nèi)切酶不能（或可以）將靶DN段切斷，電泳檢測(cè)時(shí)，存在相應(yīng)DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列者原DNA片段變成短片段；不存在相應(yīng)DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列者原DN

PCR技術(shù)專題：PCR法檢測(cè)乙肝病毒（HBV）2013/11/20: PCR方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，可檢測(cè)出少至0.1pg的目的DNA。目前已廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的檢測(cè)。乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，在我國(guó)發(fā)病率很高，而且HBV與肝硬化、原發(fā)性肝癌關(guān)系密切，因此，HBV的診斷極為重要。PCR檢測(cè)HBV-DNA敏感性明顯高于傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，且能顯示HBV在體內(nèi)復(fù)制情況，直接反映患者血液的感染性，并對(duì)模棱兩可的或與臨床表現(xiàn)不符的血清學(xué)結(jié)果，PCR技術(shù)有助于明確診斷。【材料】待檢血清、HBV-PCR反應(yīng)液20管（20μl/管）、HBV-DNA裂解液、陽(yáng)性模

PCR技術(shù)專題：分子標(biāo)記——AFLP原理和操作步驟2013/11/20: 一、原理AFLP也是通過限制性內(nèi)切酶片段的不同長(zhǎng)度檢測(cè)DNA多態(tài)性的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)。但AFLP是通過PCR反應(yīng)先把酶切片段擴(kuò)增，然后把擴(kuò)增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳，多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度不同被檢測(cè)出來。實(shí)驗(yàn)中酶切片段首先與含有與其共同粘末端的人工接頭連接，連接后的粘末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)需要通過選擇在末端上分別填加了1～3個(gè)選擇性核苷的不同引物，可以達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的。這些選擇性核苷酸使得引物能選擇性地識(shí)別具有特異配對(duì)順序

PCR技術(shù)專題：PCR-SSCP 技術(shù)實(shí)驗(yàn)2013/11/14: 實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)（PolymeraseChainReaction-SingleStrandConformationPolymorphism，PCR-SSCP）技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它是一種簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的用來顯示在PCR反應(yīng)產(chǎn)物中單堿基突變（點(diǎn)突變）的手段。該方法已被用做癌基因和抑癌基因突變的篩查檢測(cè)，遺傳病的致病基因分析和基因診斷，基因制圖等領(lǐng)域。在SSCP測(cè)定中，雙鏈DNA（dsDNA）被變性成為單鏈DNA（ssDNA），每一條單鏈DNA都基于它們的內(nèi)部序

PCR技術(shù)專題：直接原位PCR（In situ PCR）2013/11/14: 原位PCR是原位雜交細(xì)胞定位和PCR的高靈敏度相結(jié)合的技術(shù)，使得靶基因檢測(cè)有了極大的改進(jìn)。此技術(shù)是在細(xì)胞（爬片、甩片或涂片）或組織（石蠟、冰凍切片）上直接對(duì)靶基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過摻入標(biāo)記基團(tuán)直接顯色或結(jié)合原位雜交進(jìn)行檢測(cè)的方法。一、組織切片和細(xì)胞樣品的制備試劑與配置10%福爾馬林；二甲苯；PBS操作方法1.用10%福爾馬林固定組織8~15hr，石蠟包埋，切片（4μm），將切片置于新鮮的二甲苯中處理5min，放入無水乙醇中浸泡5min，取出，空氣干燥；2.對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，可直接制備爬片，也可有PB

PCR技術(shù)專題：實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體實(shí)驗(yàn)步驟2013/11/14: 1樣品RNA的抽提①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。②兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育

PCR技術(shù)專題：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物克隆2013/11/14: PCR（PolymeraseChainReaction，聚合酶鏈反應(yīng)）是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法.它包括三個(gè)基本步驟：（1）變性（Denature）：目的雙鏈DNA段在94℃下解鏈；（2）退火（Anneal）:兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度（50℃左右）下與模板上的目的序列通過氫鍵配對(duì)；（3）延伸（Extension）:在TaqDNA聚合酶合成DNA的zui適溫度下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成。由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA

PCR技術(shù)專題：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法2013/11/14: 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。一、反轉(zhuǎn)

PCR技術(shù)專題：PCR技術(shù)原理、實(shí)驗(yàn)步驟和應(yīng)用2013/11/14: 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理。2.掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）是由美國(guó)PECetus公司的KaryMullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）建立的。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析zui常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)

轉(zhuǎn)染專題：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)方法2013/11/11: 摘要：本實(shí)驗(yàn)介紹了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的幾個(gè)方法。實(shí)驗(yàn)原理脂質(zhì)體（LR）試劑是陽(yáng)離子脂質(zhì)體DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下zui方面的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對(duì)轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等，對(duì)每批LR都要做。先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間，DNA可從1-5ug和孵育時(shí)間6h，開始，

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