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上海北諾生物科技有限公司
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生物化學(xué)技術(shù)專題：蘆丁的提取及鑒定2014/01/09
概述蘆丁（Rutin）廣泛存在于植物界中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含蘆丁的植物至少在70種以上，如煙葉、槐花、蕎麥和蒲公英中均含有。尤以槐花米（為植物Sophorajaponica的未開放的花蕾）和蕎麥中含量zui高，可作為大量提取蘆丁的原料。蘆丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羥基與蕓香糖（Rutinose）〔為葡萄糖（Glucose）與鼠李糖（Rhamnose）組成的雙糖〕脫水合成的苷。蘆丁為淺黃色粉末或極細(xì)的針狀結(jié)晶，含有三分子的結(jié)晶水，熔點(diǎn)為174~178℃，無水物188~190℃。溶解度：冷水
生物化學(xué)技術(shù)專題：氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的定性鑒定2014/01/07
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）學(xué)習(xí)一種鑒定氨基轉(zhuǎn)移作用的簡便方法及其原理；（2）進(jìn)一步掌握紙層析的原理和操作技術(shù)；（3）了解氨基轉(zhuǎn)移作用在中間代謝中的意義。二、實(shí)驗(yàn)原理氨基移換酶也稱轉(zhuǎn)氨酶，它能催化α-氨基酸的氨基與α-酮酸的α-酮基互換，這種作用稱為氨基移換作用。它在生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與分解等中間代謝中，在糖、脂肪、蛋白質(zhì)三類物質(zhì)代謝的相互、相互轉(zhuǎn)化上，都起著很重要的作用。任何一種氨基酸進(jìn)行轉(zhuǎn)氨作用時，都由其專一的轉(zhuǎn)氨酶催化。它們的zui適pH接近7.4。在各種轉(zhuǎn)氨酶中，以谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（簡稱谷
生物化學(xué)技術(shù)專題：PPO活性測定2014/01/07
一、原理與方法PPO催化各種酚與O2氧化為醌。本實(shí)驗(yàn)是采用鄰苯二酚為底物，在0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8的反應(yīng)體系中，PPO催化鄰苯二酚形成褐色的醌，在分光光度計410nm處使反應(yīng)體系的OD值產(chǎn)生變化，通過OD值上升的讀數(shù)變化確定PPO的酶活大小。其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液試管中加入0.05ml0.05M鄰苯二酚溶液，在30℃恒溫水浴中預(yù)熱后加入0.05ml酶液，反應(yīng)5分鐘，在分光光度計410nm處讀取吸光值。在上述條件下，以
生物化學(xué)技術(shù)專題：掌葉防己堿的提取與分離及延胡索乙素制備2014/01/07
掌葉防已堿又稱巴馬?。╬almatine），硫酸延胡索乙素又稱消旋四氫巴馬汀硫酸鹽（dltetrahydropalmatinesulphate）。延胡索乙素（CorydalisB）為鎮(zhèn)靜安定藥，用于緩解胃系統(tǒng)的疾病所引起的疼痛，臨產(chǎn)陣痛、頭痛、失眠等。中藥延胡索（元胡，CorydalisyanhusuoW.T.Wang的塊根）中含延胡索乙素的量很少，而其脫氫化合物巴馬汀在某些植物中含量卻很高。在中國華南一帶的防已科植物黃藤（Fibreursarecisapaerre）的根莖中含巴馬汀，再經(jīng)氫化反
生物化學(xué)技術(shù)專題：微生物的糖發(fā)酵2014/01/07
一、單糖發(fā)酵試驗(yàn)(一)、實(shí)驗(yàn)原理單糖發(fā)酵是將葡萄糖，乳糖或麥芽糖等分別加入蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)，使其zui終濃度為0.75~1％。并加入一定量酚紅指示劑及小倒管，制成單糖發(fā)酵管，接種細(xì)菌經(jīng)37℃培養(yǎng)18~24小時，若能分解糖產(chǎn)酸則酚紅指示劑由紅變黃，若能分解甲酸有CO2和H2等氣體形成，小倒管內(nèi)則聚集有氣泡；不分解，則指示劑不變色。(二)、實(shí)驗(yàn)材料1．菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18~24小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。2．培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵管，乳糖發(fā)酵管等。(三)實(shí)驗(yàn)方法1．將傷寒桿菌，大腸桿菌按照液體接種方法分
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：細(xì)胞凋亡的幾種檢測方法2014/01/07
一、形態(tài)學(xué)觀察方法1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細(xì)胞呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀，細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象。2、丫啶橙(AO)染色，熒光顯微鏡觀察：活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。3、臺盼藍(lán)染色：如果細(xì)胞膜不完整、破裂，臺盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死。如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。此方法對反映細(xì)胞膜的完整性，區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助。4、透射電鏡觀察：可見凋亡細(xì)胞表面微絨
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：核蛋白的免疫熒光定位實(shí)驗(yàn)2013/12/23
標(biāo)簽：核蛋白免疫熒光定位免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展zui早的一種免疫熒光技術(shù)。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。實(shí)驗(yàn)方法免疫熒光定位法實(shí)驗(yàn)方法原理免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是采用熒光素標(biāo)記的已知抗體（或抗原）作為探針，檢測待測組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原（或抗體），形成的抗原抗體復(fù)合物帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，由于受高壓汞燈光源的紫外光照射，熒光素發(fā)出明亮的熒光，這樣就可以分辨出抗原（或抗體）的所在位置及其性質(zhì)，并可利用熒光定量技術(shù)計算抗原的含量，以達(dá)
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：ELISA的操作要點(diǎn)2013/12/23
的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)一般均用板式點(diǎn)。本文將敘述板式ELISA各個操作步驟的注意要點(diǎn)，珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用，兩者均有詳細(xì)的使用說明，嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。一、標(biāo)本的采取和保存可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測定（如血
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：凝膠過濾層析實(shí)驗(yàn)2013/12/23
標(biāo)簽：凝膠過濾層析凝膠過濾層析（gelfiltrationchromatography）法又稱排阻層析或分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖類物質(zhì)，使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)方法蛋白質(zhì)的凝膠過濾分離實(shí)驗(yàn)材料蛋白質(zhì)試劑、試劑盒凝膠過濾緩沖液儀器、耗材布氏漏斗凝膠過濾層析柱分光光度計實(shí)驗(yàn)步驟1.如果凝膠過濾的介質(zhì)是干粉，則需在凝膠過濾緩沖液中*溶脹。2.在遠(yuǎn)離過往通道及直接光照的恒
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)2013/12/23
標(biāo)簽：蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)很多膜可作為蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移的固相支持物，如重氮化纖維素膜（DPT，DBM）、DEAE-纖維素膜、尼龍膜等，但用的zui多的還是硝酸纖維素膜（NC膜），該膜與蛋白質(zhì)以非共價的疏水作用形式結(jié)合，結(jié)合能力約為80μg/cm2。實(shí)驗(yàn)方法基本方案實(shí)驗(yàn)材料蛋白質(zhì)試劑、試劑盒轉(zhuǎn)移緩沖液甲醇電極緩沖液儀器、耗材電轉(zhuǎn)移槽電泳儀實(shí)驗(yàn)步驟1.剪6塊3MM濾紙和一塊NC膜。2.將剪好的3MM濾紙和NC膜在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡3-5分鐘。3.按下列過程安裝轉(zhuǎn)移裝置，將塑料支架平放在含轉(zhuǎn)移緩沖液的托盤中，在塑料支
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)回收實(shí)驗(yàn)2013/12/17
標(biāo)簽：蛋白質(zhì)回收試驗(yàn)，是“對照試驗(yàn)”的一種。當(dāng)所分析的試樣組分復(fù)雜，不*清楚時，向試樣中加入已知量的被測組分，然后進(jìn)行測定，檢查被加入的組分能否定量回收，以判斷分析過程是否存在系統(tǒng)誤差的方法。所得結(jié)果常用百分?jǐn)?shù)表示，稱為“百分回收率”，簡稱“回收率”。實(shí)驗(yàn)方法基本方案實(shí)驗(yàn)材料蛋白質(zhì)試劑、試劑盒SDSDTT脫色液染色液儀器、耗材電泳儀透析膜實(shí)驗(yàn)步驟1.凝膠浸泡在染色液中于室溫緩慢搖動染色15~20min，然后移至脫色液中于4℃溫和搖動下脫色2~3h。2.切下染色后的凝膠條帶，于4℃水中浸泡2~3h
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性測定2013/12/17
谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是指催化具有親電取代基的外源性化合物與內(nèi)源的還原谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)的酶?？纱呋喾N反應(yīng)包括烴基、芳基、芳烴基、烯基和氧基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)的關(guān)鍵酶，催化谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)的起始步驟，主要存在于胞液中。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶有多種形式，根據(jù)作用底物不同，至少可分為下列5種：1、谷胱甘肽S-烷基轉(zhuǎn)移酶：催化烷基鹵化物和硝基烷類化合物的谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)。主要存在于肝臟和腎臟。2、谷胱甘肽S-芳基轉(zhuǎn)移酶：主要催化含有鹵基或硝基的芳烴類或其它環(huán)狀化合物的谷胱甘
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：鎘--血紅素法測定組織水平金屬硫蛋白2013/12/17
金屬硫蛋日(metallothionein，MT)是富含金屬及硫的可誘導(dǎo)性蛋白，它可被某些金屬(Bi，Zn，Cu等)、激素（糖皮質(zhì)激素）、細(xì)胞毒藥物（順鉑及烷化劑）及其他與物理化學(xué)刺激相關(guān)的病理生理狀況所誘導(dǎo)。MT廣泛存在于哺乳婁動物除結(jié)締組織外的幾乎所有組織中，肝、腎、胰、腸中zui為豐富，從已有的研究中發(fā)現(xiàn)：MT增加可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對烷化劑及DDP產(chǎn)生耐藥性。耐DDP的細(xì)胞MT含量增加且MTmRNA過度表達(dá)。DDP耐藥表型的逆轉(zhuǎn)伴隨MT含量增加且MTmRNA過度表達(dá)；用編碼MT的真核細(xì)胞表達(dá)載
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：免疫篩選實(shí)驗(yàn)2013/12/17
標(biāo)簽：免疫篩選根據(jù)抗原-抗體相互作用的原理從群體中選出目的物的技術(shù)。如用抗體檢測表達(dá)型的基因文庫所合成的蛋白質(zhì)，從而篩選出目的基因的克隆。實(shí)驗(yàn)方法基本方案實(shí)驗(yàn)材料cDNA試劑、試劑盒BHI氯霉素NaOHSSC氯仿異戊醇TESSDSmRNA甲硫氨酸乙醇乙酸鈉免疫沉淀緩沖液儀器、耗材轉(zhuǎn)子硝酸纖維濾膜離心管微量多孔洗滌儀實(shí)驗(yàn)步驟1.往微量滴定板的每孔中加入250μl含適當(dāng)抗生素的選擇性BHI培養(yǎng)液，并分別接種獨(dú)立的cDNA克隆，37℃溫育過。2.在250ml燒瓶中加入50mlBHI/抗生素培養(yǎng)液，以1
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：豆粕中尿素酶活性的測定2013/12/17
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諟y定尿素酶活性的各種方法的基本原理及方法步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理將粉碎的大豆制品與中性尿素緩沖溶液混合，在30℃保持30min后，尿素酶催化尿素水解產(chǎn)生氨的反應(yīng)。用過量的鹽酸溶液中和所產(chǎn)生的氨，再用氫氧化標(biāo)準(zhǔn)溶液回滴。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備1、樣品篩：孔徑200μm；2、酸度計：精度0.02pH，附有磁力攪拌器和滴定裝置；3、恒溫水?。嚎煽販?0±0.5℃；4、試管：直徑18mm，長150mm，有磨口塞子；5、精密計時器；6、粉碎機(jī)：粉碎時應(yīng)不生強(qiáng)熱（如球磨機(jī)7、分析天平．感量0.1mg；8、移
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)的提取及粗分離實(shí)驗(yàn)2013/12/11
標(biāo)簽：蛋白質(zhì)提取粗分離分離純化蛋白質(zhì)，首先要從原材料中提取目的蛋白，然后通過粗分離的方法除去大量雜質(zhì)，zui后進(jìn)行精細(xì)分離，得到目的蛋白。本實(shí)驗(yàn)以新型基因重組人TNF為例闡明重組蛋白TNF的提取及初步分離。實(shí)驗(yàn)方法硫酸銨鹽析法實(shí)驗(yàn)方法原理分離純化蛋白質(zhì)，首先要從原材料中提取目的蛋白，然后通過粗分離的方法除去大量雜質(zhì)，zui后進(jìn)行精細(xì)分離，得到目的蛋白。本實(shí)驗(yàn)以新型基因重組人TNF為例闡明重組蛋白TNF的提取及初步分離。TNF的提取是將發(fā)酵菌體裂解，在一定的條件和溶液中，使被提取的TNF充分釋放出
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：離子交換色譜2013/12/11
4，洗脫方式的選擇,離子交換色譜洗脫方式有三種：一是改變緩沖液pH，使蛋白質(zhì)從吸附狀態(tài)變?yōu)榻馕綘顟B(tài)。如在陰離子交換色譜中，通過降低流動相pH使吸附在柱子上的帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶正電，從而達(dá)到解吸附，在陽離子交換色譜中則是通過升高流動相pH的方法達(dá)到解吸附；二是增加緩沖液的離子強(qiáng)度，將吸附強(qiáng)的分子從離子交換劑上替換下來；三是緩沖液pH和離子強(qiáng)度同時改變。無論哪一種方法，都可用階段洗脫和梯度洗脫兩種方式進(jìn)行。階段洗脫是用幾個不同pH緩沖液或幾個不同鹽濃度的緩沖液逐步進(jìn)行洗脫。即pH和離子強(qiáng)度變化不連
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：液相色譜之排阻液相色譜2013/12/11
液相色譜（HighRerformanceLiquidChromatography,HPLC）又叫高壓、高速、近代液相色譜，通常叫做液相色譜。它是60年代中期才建立的一種快速分離化合物的方法，到了70年代后期才廣泛用于蛋白質(zhì)的分離純化方面，現(xiàn)已成為分離純化蛋白質(zhì)非常有效的方法之一。和經(jīng)典常壓色譜相比它有以下特點(diǎn)：1、HPLC分離、純化蛋白質(zhì)的速度快。通常半小時左右可進(jìn)行一次，大大縮短了純化蛋白質(zhì)的時間；2、分辯率高。一根長10cm的色譜柱可分離十幾種以上的物質(zhì)；3、適應(yīng)面廣，靈活性強(qiáng)，幾乎所有的蛋
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：TNF-α生物學(xué)活性檢測方法2013/12/11
基本原理TNF的生物學(xué)活性之一是能直接殺傷腫瘤細(xì)胞。TNF與相應(yīng)受體結(jié)合后向細(xì)胞內(nèi)移，被靶細(xì)胞溶酶體攝取導(dǎo)致溶酶體穩(wěn)定性降低，各種酶外泄，引起細(xì)胞溶解。腫瘤細(xì)胞株對TNF-α的敏感性有很大的差異，用放線菌素D、絲裂酶素C、放線菌酮等處理腫瘤細(xì)胞，可明顯增強(qiáng)TNF-α殺傷腫瘤細(xì)胞活性。材料和試劑1，*培養(yǎng)基（1）10%FCS-DMEM培養(yǎng)液（V/V）。2，*培養(yǎng)基（2）3%FCS-DMEM培養(yǎng)液（V/V）0.5-1μg/ml放線菌素-D。3，0.05%結(jié)晶紫溶液：取50mg結(jié)晶紫，用20ml無水乙
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：磷酸氨基酸分析實(shí)驗(yàn)2013/12/11
標(biāo)簽：磷酸氨基酸分析鑒定蛋白質(zhì)中磷酸化的氨基酸殘基是很有意義的。磷酸化作用發(fā)生在蛋白質(zhì)的絲氨酸、蘇氨酸和酩氨酸時，通過部分的HCl水解及接著進(jìn)行雙向薄層電泳，可以便利地鑒定標(biāo)記的磷酸氨基酸。實(shí)驗(yàn)方法酸水解法實(shí)驗(yàn)材料磷酸化蛋白質(zhì)試劑、試劑盒印度墨汁HCl磷酸氨基酸混合物電泳緩沖液茚三酮儀器、耗材PVDF膜烘箱離心機(jī)離心管纖維素薄層色譜濾紙薄層電泳儀實(shí)驗(yàn)步驟1.放射性標(biāo)記的磷酸化蛋白質(zhì)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行制備電泳。電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用水洗膜數(shù)次，不要讓膜變干。2.用30~50ml印度墨
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