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士鋒生物ELISA標準操作及技術服務的常見問題分析2014/01/07

一.elisa標準操作要點的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的本公司要求使用的純化水電導率小于1.5μs/cm。1.標本的采取和保存大部分ELISA檢測均以血清為標本。血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會

吞噬細胞吞噬功能檢測2014/01/06

一、基本原理吞噬細胞具有對異物(細菌、綿羊紅細胞、雞紅細胞等)吞噬和消化的功能，在機體固有免疫中發揮重要作用。小鼠腹腔內注射硫代乙醇酸鈉，可刺激巨噬細胞的聚集。四日后小鼠腹腔內注入羊紅細胞懸液，一小時后解剖收集腹腔吞嗜細胞，染色、鏡檢可觀察對羊紅細胞的吞嗜現象。通過計算吞嗜百分比或吞噬指數可測定吞噬細胞的吞嗜功能。二、材料1.ICR品系小鼠（北京大學醫學部實驗動物中心提供）2.pbs緩沖液3.3％硫代乙醇酸鈉4.羊紅細胞（1％懸液，北京大學醫學部實驗動物中心提供）5.解剖器材、注射器、尖吸管、橡

士鋒生物免疫酶測定法（ELISA）介紹2014/01/02

（一）elisa實驗原理及類型將已知抗體或抗原結合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測定時將待檢標本和酶標抗體或酶標抗原按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發生反應，用洗滌的方法分離抗原抗體復合物和游離物成分，然后加入底物顯色，進行定性或定量測定。ELISA可用于檢測抗體，也可用于檢測抗原。根據檢測目的和操作步驟的不同，通常有三種類型的檢測方法。1．間接法此法是檢測抗體zui常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體上，加入待測血清(抗體)與之結合，洗滌后，加酶標抗體和底物進行測定。其原理見圖1

士鋒生物單克隆抗體技術原理2013/12/30

B淋巴細胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細胞的這種能力和量是有限的，不可能持續分化增殖下去，因此產生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細胞與非分泌型的骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，再進一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細胞是既具有瘤的無限生長的能力，又具有產生特異性抗體的B淋巴細胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細胞進行培養或注入小鼠體內即可獲得大量的價、單一的特異性抗體。這種技術即稱為單克隆抗體技術。制備單克隆抗體的方法是用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶或

士鋒生物動物的選擇與免疫2013/12/27

（一）動物的選擇目前應用zui廣的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠為好。就品系而言以Balb/c小白鼠應用zui廣，因為所有的小白鼠骨髓瘤系均從Balb/c小白鼠系誘導出來。Balb/c系小白鼠必須用純系的，雌雄均可，以8~12周齡為宜。大白鼠也可，能產生較多量的單克隆抗體。現在已經在小鼠雜交瘤的基礎上，發展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人雜交瘤技術。（二）免疫一般而言，抗原的純度不很重要，特別是免疫原性較強的抗原。免疫程序、劑量和方法是關系到是否能得到所需要的單克隆抗體的關鍵之一。正常小鼠脾臟含有

血清IgG的分離制備—鹽析法2013/12/24

（一）原理IgG是免疫球蛋白（Immunoglobulin，簡稱IgG）的主要成分之一，分子量約為15萬~16萬，沉降生活費數約為7s。IgG是動物和人體血漿的重要成分之一。血漿蛋白質的成分多達70余種，要從血漿中分離出IgG，首先要進行盡可能除去其他蛋白質成分的粗分離程序，使IgG在樣品中比例大為增高，然后再純化而獲得IgG。鹽析法是粗分離蛋白質的重要方法之一。許多蛋白質在純水或低鹽溶液中溶解度較低，若稍加一些無機鹽則溶解度增加，這種現象稱為“鹽溶”（Saltingin）。而當鹽濃度繼續增加到

士鋒生物單克隆抗體的制備2013/12/20

（一）雜交瘤細胞的大量繁殖克隆化的細胞可以在體外進行大量培養，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過體外培養法得到的單克隆抗體有限，其不能超過特定的細胞濃度，且每天要換培養液。而體內雜交瘤細胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細胞具有從親代淋巴細胞得來的腫瘤細胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無胸腺的裸鼠），雜交瘤細胞就開始無限地繁殖，直至宿主死亡。產生腫瘤細胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體，這種抗體的效價往往高于培養細胞上清液的100~1

免疫膠體金技術實驗原理2013/12/18

（一）原理免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆

士鋒生物抗體的制備原理與方法2013/12/18

抗體的制備方法與原理一、抗血清的制備有了質量好的抗原，還必須選擇適當的免疫途徑，才能產生質量好（特異性強和效價高）的抗體。（一）用于免疫的動物作免疫用的動物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據抗原的生物學特性和所要獲得抗血清數量，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動物反應良好，而且能夠提供足夠數量的血清，用于免疫的動物應適齡，健壯，無感染性疾患，為///雄性，此外還需十分注意動物的飼養，以消除動物的個體

免疫組織化學:幾種溶液的配制方法2013/12/16

1、PBS:取ZLI-9061PBS溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，測pH值應在7.2~7.4之間，若偏離此范圍，請用0.1N的HCL或NaOH調整。2、TBS：2.1Tris緩沖液配方：（0.5MpH7.6）Tris（三羥甲基氨基甲烷）60.57g1NHCL約420ml雙蒸水加至1000mlTris緩沖液配制方法：先以少量雙蒸水（300~500ml）溶解Tris，加入HCl后，用HCl（1N）或NaOH（1N）將pH調至7.6，zui后雙蒸水加至1000ml。此液為儲備液，4℃冰箱中保存。2

士鋒生物Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞2013/12/13

測定細胞免疫功能首先要從人或動物外周血或組織中獲取有活性的細胞，如淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞等。取得有活性的細胞應根據不同目的，采用不同方法，考慮（1）細胞純度；（2）細胞獲得量；（3）細胞活力；（4）使用方法的簡易程度和本室條件等。目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細胞。（一）原理:常用來分離人外周血單個核細胞（PBMC）的分層液比重是1.077±0.001的聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F／H）分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，犌

士鋒生物細胞培養常見問題解析2013/12/11

1、如何選用培養基?培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養，各種目的無血清培養的是AIMV培養基（SFM）2、為什么要熱滅活血清?加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。3、L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?L

細胞轉染實驗之如何做好脂質體介導DNA轉染2013/12/09

脂質體介導是目前條件下zui方便的轉染方法之一，適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，其轉染率高，優于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進行轉染時，首先需優化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做：*，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1～5μg和孵育時間6小時開始，按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者*的劑量，確定出轉染時間（2～24小時）。因LR

士鋒生物常用的標記免疫酶及其底物2013/12/05

.標記酶的選擇條件⑴活性高，分解底物的能力強。⑵特異性強，即作用于底物的專一性強。⑶與抗原抗體結合后仍保持酶的活性。⑷與底物作用可以顯色。⑸純度高、易純化，即含雜蛋白少。⑹可溶性（水溶性）好，在溶液中穩定。⑺測定方法簡單。⑻酶來源方便、價格低廉。2.符合條件的酶⑴辣根過氧化物酶（HorseradishperoxidaseHRP），分子量40000。⑵堿性磷酸酶（AlkalinephosphataseAKP），分子量82000。⑶β-半乳糖甙酶（β-galactosidase），分子量540000

士鋒生物免疫血清的鑒定、純化和保存2013/12/03

一、免疫球蛋白的提取與鑒定：各類免疫球蛋白及其與其它血清蛋白間，根據它們的分子大小、電離密度、等電點以及在水溶液中的溶解度不同等，得以相互鑒別與分類。利用上述特性，還可以從液體中分離和提取各種免疫球蛋白。（一）免疫球蛋白的分離提取：1．鹽析法（Saltfractionation）：蛋白質在不同濃度的鹽溶液中相對溶解度不同。血清γ球蛋白在一定濃度鹽溶液中易于沉淀，而白蛋白則不易沉淀，據此可將二者分離。其方法步驟如下：（1）配制飽和硫酸銨溶液：取500ml蒸餾水加熱至70~80℃，將400g硫酸銨溶

士鋒生物免疫印跡法2013/12/02

次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物，使區帶染色。常用的HRP底物為3，3’-二氨基聯苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍紫色）。陽性反應的條帶清晰可辨，并可根據SDS-PAGE時加入的分子量標準，確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個有效的分析手段，不僅廣泛應用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。在艾滋病病毒感染中此法作為確診試驗。抗原經電泳轉移在硝酸纖維素膜上后，將膜切成小條，配合酶標抗

士鋒生物免疫組織化學技術2013/11/29

（一）免疫組織化學技術的基本原理免疫組織化學技術是用顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項技術。即先將組織或細胞中的某些化學物質提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（*抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結合，將抗原放大，由于抗體與抗原結合后形成的免疫復合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學方法將抗原抗體反應部

士鋒生物ELISA（酶聯免疫吸附試驗）實驗分析2013/11/28

Reagents:PBS（pH7.3）CoatingSolution:0.1MSodiumCarbonate（pH9.6）with0.02%SodiumAzideWashSolution:0.9%NaCl-0.05%Tween20（NaCl/T）PBS-TA:PBS-Tween20（0.05%）-sodiumazide（0.02%）pH7.3APSubstrateBuffer:0.05Msodiumcarbonate-0.001MMgCl2（pH9.3）HRPSubstrate:Mixequal

士鋒生物免疫學實驗室實驗須知2013/11/26

一．實驗課的目的要求免疫學實驗課的目的是加強和鞏固對課堂講授的基本理論的理解和體會，學習和掌握免疫學實驗的基本操作技術。為今后的實際工作和科研工作打下基礎。為上好免疫學實驗課，要求同學做到如下各點：1.課前務必做好充分預習，明確實驗目的、原理、方法及操作中的注意事項，做到心中有數。2.在實驗進程中，嚴格按照實驗指導所列步驟和要求進行操作，堅持實驗的嚴肅性、嚴格性、嚴密性。3.真實記錄實驗結果，對錯誤的結果要認真分析，找出原因，得出結論。實驗完成后，寫出實驗報告及時交給老師批改。4.嚴格遵守實驗室

士鋒生物吞噬細胞吞噬功能檢測2013/11/21

一、基本原理吞噬細胞具有對異物（細菌、綿羊紅細胞、雞紅細胞等）吞噬和消化的功能，在機體固有免疫中發揮重要作用。小鼠腹腔內注射硫代乙醇酸鈉，可刺激巨噬細胞的聚集。四日后小鼠腹腔內注入羊紅細胞懸液，一小時后解剖收集腹腔吞嗜細胞，染色、鏡檢可觀察對羊紅細胞的吞嗜現象。通過計算吞嗜百分比或吞噬指數可測定吞噬細胞的吞嗜功能。二、材料1.ICR品系小鼠2.pbs緩沖液3.3％硫代乙醇酸鈉4.羊紅細胞（1％懸液，北京大學醫學部實驗動物中心提供）5.解剖器材、注射器、尖吸管、橡皮吸頭、小試管及載玻片、6.瑞氏染