次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍(lán)紫色）。陽(yáng)性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDS-PAGE時(shí)加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個(gè)有效的分析手段，不僅廣泛應(yīng)用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。在艾滋病病毒感染中此法作為確診試驗(yàn)。抗原經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜上后，將膜切成小條，配合酶標(biāo)抗體及顯色底物制成的試劑盒，可方便地在實(shí)驗(yàn)室中供檢測(cè)用。根據(jù)出現(xiàn)顯色線條的位置可判斷有無(wú)針對(duì)病毒的特異性抗體。
一． SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）
基本原理是聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體acr聚合成長(zhǎng)鏈并通過雙功能化合物甲叉雙丙烯酰胺Bis交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的機(jī)械性、彈性、透明度、粘著度取決于凝膠的總濃度，總濃度越大，平均孔徑越小，機(jī)械強(qiáng)度越強(qiáng)。T是Acr與Bis的總百分濃度，C是Acr：Bis的重量百分比，T恒定，C為4%時(shí)，有效孔徑zui小，C大于或小于4%時(shí)，有效孔徑均變大；C恒定，T增加，有效孔徑降低。聚合過程由TEMED（四甲基乙二胺）和過硫酸銨激發(fā)。
陰離子去垢劑SDS能破壞蛋白質(zhì)中的氫鍵和疏水鍵，按一定比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷量，掩蓋了各種蛋白質(zhì)分子間的天然電荷差異；加入巰基乙醇使電泳的遷移率不再愛原有分子形狀的影響。蛋白質(zhì)的遷移率將主要取決于其分子量的大小
基本步驟：
1.收集蛋白樣品（Protein sample preparation）
可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖海呀赓N壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，用SDS上樣緩沖液，裂解能力強(qiáng)，能提取細(xì)胞總蛋白，可用來檢測(cè)多種蛋白，包括磷酸化蛋白。另外，常用的還有非離子去垢劑緩沖液裂解法，低滲緩沖液裂解法。可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提.
2.蛋白質(zhì)濃度測(cè)定：
收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。更方便的方法是選用成套的裂解液和定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)。如果濃度過高，可按比例稀釋，讀出蛋白濃度后，再折算回原樣品濃度。
3. 電泳（Electrophoresis）
配制SDS-PAGE凝膠，在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。
注意：Acr和Bis單體對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和皮膚有毒性作用，TEMED對(duì)粘膜和上呼吸道組織及皮膚有很大的破壞作用
4．電泳結(jié)果檢查：
如果要做Western Blot，是否需要先檢查電泳結(jié)果呢？能先看看結(jié)果如何再進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)膜當(dāng)然。考馬斯亮藍(lán)使用簡(jiǎn)便快速，可以分辨1ug左右的條帶，是通用的蛋白PAGE膠電泳染色方法。銀染操作復(fù)雜一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白。可是由于考馬斯亮藍(lán)染色或者銀染經(jīng)過固定不可逆結(jié)合，會(huì)干擾后面的Western Blot實(shí)驗(yàn)，很多人會(huì)選擇省略掉這一步——同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉(zhuǎn)膜，一般也可以說明問題。如果想在轉(zhuǎn)膜前看看電泳結(jié)果，你需要用SYPRO Tangerine——這種金色熒光蛋白染料靈敏度很高——檢測(cè)4ng-8ng蛋白，接近銀染，但使用非常簡(jiǎn)單，zui重要的是由于不用酸堿或者有機(jī)溶劑固定，不干擾蛋白活性，特別適合Western轉(zhuǎn)膜前的染色，或者非變性膠的活性蛋白的檢測(cè)（比如染色后還需要在膠上進(jìn)行活性檢測(cè)等等）。可惜SYPRO Tangerine價(jià)格挺貴的，500ul（5000x）要2000元，即使很節(jié)約的用只夠大概100多次呢。所以實(shí)惠的方法是：麗春紅S，直接染色轉(zhuǎn)移膜，檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果，充分脫色后不干擾Western結(jié)果。麗春紅的檢測(cè)靈敏度和考馬斯亮藍(lán)差不多。