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酶免疫電泳技術2012/06/02

一，酶免疫電泳技術的原理抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中電泳時，在堿性緩沖液的條件下，抗原帶負電，向正極移動。不同分子量或還不同電荷的抗原，在相同條件下，移動距離不等。這些在不同部位的抗原，再與相關抗體經擴散形成免疫沉淀線。酶免疫電泳技術中的抗原與抗體就是酶和它的相應抗體球蛋白。酶抗原與酶抗體形成的免疫復合物是用底物顯色的，由于酶反應的高度靈敏性，使酶免疫電泳技術成為一項靈敏度高的檢測技術，但僅局限于酶蛋白的分析鑒定。二，辣根過氧化物酶（HRP）免疫電泳技術的程序1，器材與設備電泳儀（包括電泳槽）；溫箱

活細胞間接免疫熒光法2012/06/02

一．實驗器材：1．器材：40孔塑料板、40孔板離心機、微量加樣器、振蕩器、蓋玻片、熒光顯微鏡等。2．試劑：單抗隆抗體（單抗）、熒光標記抗鼠免疫球蛋白、PBS（pH7.2-7.4）、甘油、疊氮鈉（NaN3）等。二．方法（微量法）1．將分離好的單個核細胞用PBS洗2次，1000rpm每次10分鐘。用含0.1%NaN3PBS調細胞濃度在0.5-1×108/ml（5000萬-1億/ml），加在40孔板上，每孔10ul，含5-10×105細胞，然后加入單抗（*抗體）50ul（同時加入AB型血清5ul）振蕩

DNA合成儀的發展2012/05/19

當前DNA合成儀的主要生產廠商都致力于機器性能的完善和應用領域的開拓以及率、高產率的儀器的開發與研究。中國臺灣科學委員會“基因醫藥衛生科技研究計劃”中的基因生物技術組已經成功研發**臺高密度復制DNA合成儀，可以同時合成384條不同DNA，每日可合成768條DNA，并可以配合聚合酶連鎖反應裝置，大量復制各種基因，不但節省時間，也可節省大量人力，這部機器能復制動物、人體、植物的基因甚至是防偽基因。由于人們所需要的大部分核酸的堿基對數量遠遠超過目前DNA合成儀可以合成的zui長核酸鏈的堿基對數量，因

多肽合成的基本原理2012/05/19

多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，合成一般從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。過去，多肽合成是在溶液中進行，現在多采用固相合成法從而大大地減輕了每步產品提純的難度。為防止副反應的發生，合成柱與添加的氨基酸的側鏈都被保護，羧基端是游離的，且在反應之前必須活化。化學合成方法有兩種，即Fmoc法和Boc法。由于Fmoc比Boc有很多優勢，現在大多采用Fmoc法合成。甲基化聚苯乙烯樹脂，目前，廣泛采用比氯甲基樹脂更加穩定的對乙酰氨基芐酯（PAM）樹脂。合成肽酰胺時采用二苯甲胺型樹脂。Boc保護。—氨

特異性循環免疫復合物的測定2012/05/12

特異性CIC分為單特異性CIC和雙特異性CIC兩類。前者適用于檢測已知抗原及其相應抗體組成的CIC。雙特異性CIC是指對組成CIC的抗原、抗體和補體中某兩種成分組合明確的CIC，常采用的檢測方法為ELISA和RIA技術，需要兩種特異性各異的抗體。因此，檢測要求條件較高，但能較全面地反映CIC的病理意義。在檢測雙特異性CIC時，由于要求有兩種特異性抗體，每種抗體均可用作包被或檢測抗體，故具體到檢測某類雙特異性CIC時，根據兩種抗體的不同，可使用兩種方法。以ELISA法為例，如檢測HBsAg／IgC

胰蛋白酶解離法檢測HBsAg-CIC2012/05/12

用3．5％PEG選擇性地沉淀血清中CIC，繼之用胰蛋白酶消化沉淀物中的抗體蛋白，分離出抗原部分，用反向間接血凝法測定HBsAg滴度。與不加胰蛋白酶的對照管比較，如HBsAg滴度升高，則說明有HBsAg-CIC的存在。1．試劑①pH8．4硼酸鹽緩沖液（BBS）：配制法同*節中PEG沉淀試驗；②7％PEG及3．5％PEG溶液：用BBS配制；③10mg／mL胰蛋白酶溶液：用pH8．2巴比妥緩沖液配制。2．操作步驟（1）在測定管與對照管內務加待測血清0．2mL。（2）兩管各加pH8．4BBSl．8mL，

IL-16的檢測2012/05/05

即以前的淋巴細胞趨化因子（1ymphocytechemoattractantfactor，LCF）。主要由CD8+T淋巴細胞產生，對T淋巴細胞特別是CD4+細胞具有選擇性趨化作用。（1）IL-16的誘生1）分離PBMC，調整細胞濃度為3X106／mL，加入平底培養板中，置37℃5％C02溫箱培養。2）加入血清素（serotonin，即5-羥色胺），使終濃度為10—4moL／L，培養24h，離心收獲上清用于IL-16活性檢測。（2）IL-16的測定：可根據IL-16對淋巴細胞的趨化作用測定其活性。

IL-17的檢測2012/05/05

IL-17是新近被確認的一種細胞因子，由T細胞，主要是CD4+T細胞產生，其靶細胞廣泛。可激活轉錄因子NF-KB，誘導纖維母細胞產生IL-6、ID8、GM-CSF、和膜性細胞間粘附分子1（1CAM-1），促進由亞適劑量PHA所誘導的T細胞增殖。目前編碼IL-17及其受體的基因核苷酸序列已被部分測定。（1）IL-17的誘導：取人PBMC或純化的CD4+T細胞，加入誘導劑（PMA5ng／mL+ionomycin3ug／mL，或ConA63ug／mL，或抗CD28抗體+CD3抗體），37℃孵育48—7

三條途徑對C3轉化酶的激活2012/04/21

1．經典途徑始于抗體（主要是IgM和I知）對病原體或細胞表面抗原分子的識別及抗原抗體復合物的形成。補體C1q分子結合抗體后觸發這一經典途徑。C1q和Clr、Cls共同組成O復合物（圖7d3A），Clr和Os隨著Clq的活化而依次激活。Cls活化后專一性地使下列兩個補體成分分解：出分解成FAa，和Ob；C2分解成C2a和C2l被激活的兩個大片段C4b和C2b迅速沉積到細胞表面，共同構成經典途徑中顯示酶解活性的C3轉化酶即C4b2b。補體Cl復合體及攻膜復合物形成過程示意圖2．凝集素途徑由甘露糖結合

補體的效應功能和補體級聯反應中的后期事件2012/04/21

1．介導炎癥反應斟、C3、C5分解產生的小片段CAa、C3a和C作為一種肽介導物（peptidemediator）參與誘導局部炎癥反應，起著招募吞噬細胞的作用。2．調理作用C3是血漿中濃度zui高的補體蛋白，含量為1．2mg／ml。一個C3轉化酶可以分解1000個C3分子，由此產生大量的C3b。C3b憑借其暴露出來的硫酯鍵，以共價形式結合于病原體表面，否則C3b將因水解而失活。因而補體激活的一個重要結果，是使C3b大量沉積和覆蓋在病原體或靶細胞的表面。另一方面，吞噬細胞帶有識別C3b的受體，有利

吞噬防御屏障2012/04/14

吞噬細胞攝入胞外物質主要有兩種形式：胞吞和吞噬。（1）胞吞（endocytosis）：指胞外組織液中的大分子被細胞攝人。其方式又有兩種，分別稱為胞飲（扛nocytosis）和受體介導的胞吞（圖7—17）。前者直接吞人可溶性大分子；后者選擇性地吞人受體—大分子復合物。隨后，帶有大分子的胞吞小泡相互融合而進入內體（endosome）。內體中的酸性內含物使大分子和受體分子解離，后者可再循環至細胞表面，而帶有游離大分子的內體則和來自高爾基體的初級溶酶體（1ysosome）融合成為次級溶酶體。溶酶體內含有

血漿酶炎癥介質2012/04/14

炎癥是針對各種刺激物如感染和組織損傷的一種生理性應答。有三個重要作用：①把效應分子和效應細胞輸送到感染部位，增強防御*線M甲對入侵病原體的殺傷；②提供一個生理屏障，防止感染擴散（抗感染炎癥屏障）；③加快損傷組織的修復。參與炎癥反應的介質主要包括趨化因子、細胞因子、血漿酶介質和脂類炎癥介質。血漿酶介質血漿中有四個酶系統，在一旦出現組織損傷時可被激活而形成相互作用的網絡，產生大量炎癥介質。血漿酶介質及其在炎癥反應中的作用（1）激肽系統：組織損傷首先激活血漿酶原Hageman因子（又稱凝血因子Ⅻ），引

基于細胞物理性狀的免疫細胞分離方法2012/04/07

1、根據各種細胞比重的差異（1）自然沉降法（2）密度梯度離心法①Ficoll-Hypaque密度梯度離心法：人外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）包括淋巴細胞和單核細胞，其體積、形狀和比重與其他細胞不同，紅細胞和多核白細胞比重較大，為1.092左右，而淋巴細胞和單個核細胞比重為1.075左右。利用密度在1.077±0.001g/L之間近于等滲的Ficoll-Hypaque混合溶液（稱為淋巴細胞分層液）作密度梯度離心時,各種血液成分將按密度梯

MTT比色法檢測IL-2的生物活性2012/03/10

【基本原理】IL-2的生物活性檢測法是檢測IL-2對靶細胞（或反應細胞）的促增殖作用的能力。IL-2反應細胞增殖程度可以增殖細胞中DNA合成或酶活性為指示系統，通過測定3H-TdRDNA摻入量或MTT比色法OD值，并通過與標準品對照，間接測定IL-2的生物活性單位。以下三類細胞可作為IL-2的檢測細胞：①IL-2依賴細胞株，如CTLL，CTLL-2，尤以后者zui常用；②有絲分裂原活化的T淋巴母細胞；③小鼠胸腺細胞。下面主要介紹以CTLL-2細胞作為反應細胞檢測IL-2的生物學活性，又包括MTT

3H-TdR摻入法檢測IL-2的生物活性2012/03/10

【材料和試劑】（1）反應細胞：CTLL-2，存活率應＞95%。（2）IL-2標準品：倍比稀釋為不同濃度。（3）待測樣品：倍比稀釋為不同濃度。（4）10%Fcs-RPMI-1640*培養液（5）3H-TdR（6）96孔培養板，刻度吸管，毛細吸管，刻度離心管，離心機，加樣器（頭），細胞計數板，倒置顯微鏡，超凈工作臺，CO2培養箱，微量細胞收集儀，玻璃纖維濾紙，?液閃計數儀。【操作步驟】（1）用10%FCS-RPMI-1640培養液洗滌CTLL-2細胞2次，1000r/min離心5min，以去除原生長

基本術語和常用測量參數2012/03/03

（一）像素與灰度1．像素是構成顯示器圖像的zui基本單元，按行和列（X和Y）方向排列成矩列。任何一矩列均對應一個點，這些點稱為像素。單位面積屏幕上像素愈多則圖像愈清晰，即分辨率愈高，顯示的圖像也越細膩和真實。數字圖像的像素越多，灰度量化等級也越多，圖像分析儀分析出的結果越準確。但是。當像素達到一定量時，由于圖像分析儀計算機的存儲量和計算量呈幾何級數增大，從而減慢了計算機的處理速度。2．灰度系指圖像每一像素的明暗（深淺）程度，即該像素的圖像由黑到白變化的量化等級。顯微圖像分析系統的灰度量化等級均為

流式細胞術的常用樣品制備方法2012/02/25

流式細胞術的實驗檢測對象是單細胞懸液，因此，在組織化學和免疫組織化學實驗中欲對待測樣品細胞進行分類計數，也需把樣品制備成細胞懸液，并要求被檢細胞大小為0．2～80pm，每個樣品中至少有20000個細胞，細胞濃度為105～107個／ml。制備成的單細胞懸液經熒光或免疫熒光標記即可上機檢測。1．單層培養細胞單細胞懸液的制備（1）棄去培養細胞（對數生長期）中的舊培養液，加入1～2ml0．25％胰蛋白酶，倒置顯微鏡下觀察，見細胞稍變圓時，停止胰蛋白酶作用。也可直接觀察培養瓶，靜置消化2～3分鐘，待細胞逐

免疫熒光標記樣品2012/02/25

用于流式細胞儀檢測的常用熒光素有FITC、TRITC、Cy3、Cy5，PE和PI，在以上各種熒光染料中，PE熒光zui強，適用于弱表達抗原；FITC*，適用于強表達抗原，適用范圍廣。1．直接免疫熒光標記法取一定量的細胞懸液（濃度約l×l06個／m1），直接加入熒光素標記抗體進行免疫反應（如做雙重標記或多重標記染色，可把幾種標記有不同熒光素的抗體同時加入）。4℃孵育15～30分鐘后，用l／15mol／LPBS（pH7．2～7．4）洗l～2次，加入緩沖液重懸，上機檢測。本方法操作簡便，結果準確，易于

抗神經元細胞核抗體自身抗原2012/02/18

ANNA—l靶抗原是一組特異地表達于神經元和相關腫瘤上的35—40kD堿性蛋白。分子克隆研究提示，這組蛋白抗原由三種*的基因：HuD、HuC／ple21和Hel—N1編碼。其中HuD基因位于lp34，HuC／ple21和Hel-N1分別位于19和9號染色體上。ANNA-2靶抗原分別為55k．D和80kD的兩種神經元蛋白。Hu抗原是果蠅基因Elav的一種同源基因產物，Elav與果蠅神經元分化密切相關。Elav表達于神經母細胞的細胞周期末期，其突變會導致神經元分化的停滯和神經母細胞無限制增殖。由于H

抗神經元細胞核抗體自身抗體2012/02/18

副瘤性腦脊髓炎(Paraneoplasticencephalomyetitis)及感覺神經元疾病是與小細胞肺癌相關的罕見的神經系統疾病。雖然這些疾病少見，但其確診提示肺部腫瘤存在可能性。機制可能是肺部腫瘤抗原與正常表達于中樞或周圍神經系統抗原存在交叉反伴有小腦功能紊亂的腫瘤患者，血清中存在高滴度的PCA—1表明小腦功能紊亂是副腫瘤性質引起。若患者并不是發生乳腺癌或卵巢癌，或腫瘤未表達YO抗原，則需進一步進行乳腺和婦科腫瘤檢查。在非副瘤性小腦變性患者或健康個體中，未發現PCA-1。不伴PCD的卵巢