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3H-TdR摻入法檢測IL-2的生物活性

來源:上海源葉生物科技有限公司   2012年03月10日 10:19  
【材料和試劑】
(1)         反應細胞:CTLL-2,存活率應>95%。
(2)         IL-2標準品:倍比稀釋為不同濃度。
(3)         待測樣品:倍比稀釋為不同濃度。
(4)         10% Fcs-RPMI-1640*培養液
(5)         3H-TdR
(6)         96孔培養板,刻度吸管,毛細吸管,刻度離心管,離心機,加樣器(頭),細胞計數板,倒置顯微鏡,超凈工作臺,CO2培養箱,微量細胞收集儀,玻璃纖維濾紙,ß液閃計數儀。
【操作步驟】
(1)   用10 %FCS-RPMI-1640培養液洗滌CTLL-2細胞2次,1000r/min離心5min,以去除原生長培養液(含IL-2);
(2)   用10% Fcs-RPMI-1640培養液調細胞濃度為1×105/ml;
(3)   將不同倍比稀釋度的IL-2的標準品和待測樣品分別加入96孔細胞培養板,100μL/孔,各設3復孔,同時設培養液對照;
(4)   各孔均加入CTLL-2細胞懸液,100μl/孔 ;
(5)   置37℃,5%CO2培養箱中培養24h;
(6)   每孔均加入3H-TdR,0.5μci/孔  ,繼續培養4-6h;
(7)   用微量細胞收集儀收集細胞于玻璃纖維紙上,用ß液閃計數儀測定各孔cpm值。測定CPM值的*時間應是培養液對照(無IL-2)細胞全部或大部分死亡而加有IL-2孔細胞生長旺盛時。
【結果分析】
(1)         每孔cpm值為了復孔的平均值,再減去培養液對照,即為各孔zui終c
(2)         計算IL-2活性單位(參見IL-1、IL-2的MTT比色檢測法)可按下式計算:
 

樣品IL-2活性單位
(U/ml)
=
達50%zui大增殖3H-TdR滲入值的樣品稀釋度
×
標準品IL-2活性單位
(U/ml)
達50%zui大增殖3H-TdR滲入值的標準品稀釋度

 
【注意事項】
(1)   用125I-UdR代替3H-TdR進行IL-2活性檢測。其優點是不需ß液體閃爍測定所需的試劑和設備,只需一臺小型γ計數儀即可,并可節省時間和減少ß液體閃爍操作中出現的誤差。其缺點是125I-UdR半衰期較短,需要定期供應。基本方法同3H-TdR摻入法,只是用125I-UdR代替3H-TdR,0.2μci/孔  ,然后再加入1mmol/L的5-氟尿嘧啶5μl,繼續培養24h,收集細胞用γ計數儀測定cpm值。
(2)   其余注意事項可參見MTT法檢測IL-2活性部分。

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