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IL-16的檢測

來源:上海源葉生物科技有限公司   2012年05月05日 11:19  

即以前的淋巴細(xì)胞趨化因子(1ymphocytechemoattractantfactor,LCF)。主要由CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,對T淋巴細(xì)胞特別是CD4+細(xì)胞具有選擇性趨化作用。

(1)IL-16的誘生
1)分離PBMC,調(diào)整細(xì)胞濃度為3X106/mL,加入平底培養(yǎng)板中,置37℃5%C02溫箱培養(yǎng)。
2)加入血清素(serotonin,即5-羥色胺),使終濃度為10—4moL/L,培養(yǎng)24h,離心收獲上清用于IL-16活性檢測。

(2)IL-16的測定:可根據(jù)IL-16對淋巴細(xì)胞的趨化作用測定其活性。
1)用尼龍棉分離法分離外周血中T淋巴細(xì)胞。
2)用RPMI-1640培養(yǎng)液將分離的T細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞配成5X106—lO7/mL。
3)取48孔趨化板,底板各孔加入30/uL不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品,并設(shè)培養(yǎng)液對照孔,均做3復(fù)孔。在培養(yǎng)板之上覆以8um孔徑的硝酸纖維素膜,小心讓膜與樣品溶液接觸,不能有氣泡及不讓各孔中的液體相混。
4)蓋上頂板并固定。用0.2mL培養(yǎng)液洗滌各上孔,洗去固定時可能濾人上孔的樣品溶液。在頂板各孔中加入50/uL(約2.5X105~5X105)細(xì)胞懸液,置37~C 5%C02溫箱中孵育3h,讓細(xì)胞從膜上面向下趨化運動。
5)小心取下膜,洗去膜上表面的細(xì)胞,并將膜下表面(粘附著趨化的細(xì)胞)向上置玻璃板上,固定細(xì)胞,用蘇木精染色細(xì)胞。
凸)在高倍顯微鏡下計數(shù)趨化的細(xì)胞,以對照孔每視野約10個細(xì)胞的濃度,計數(shù)5個視野的全部細(xì)胞。取3個重復(fù)孔細(xì)胞的平均數(shù)。結(jié)果以%表示:
趨化%=試驗孔細(xì)胞數(shù)/對照孔細(xì)胞數(shù)×100%

(3)注意事項:多種細(xì)胞因子具有趨化活性,如IL-8、IL-16、PANTES、MCP及MIP等。可用針對不同細(xì)胞因子的中和抗體作中和實驗對照以了解趨化活性的特異性。實驗時可將適量的中和抗體與細(xì)胞因子樣品一起加入底板各孔中,37℃作用15min,然后蓋上頂板,加入細(xì)胞。如上進(jìn)行趨化試驗,并比較中和抗體對照與試驗孔的結(jié)果可區(qū)分不同趨化因子的作用。
 

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