定型內胚層高效分化試劑盒

僅用于科學研究

產品信息

產品名稱：定型內胚層高效分化試劑盒

貨號：RC200123

批號：見包裝

試劑清單：

存儲與有效期：

該試劑盒于-80 ℃保存。所有組分必須避免反復凍融，在-80 ℃有效期為1年。融化后的*培養基于2-8 ℃保存，穩定儲存1-2周。

適用細胞：

適用于人胚胎干細胞、人誘導多能干細胞向定型內胚層分化（分化效率大于90%）。

產品介紹

人多能干細胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）包括人胚胎干細胞（hESCs）和誘導性多潛能干細胞（iPSCs）。體外hPSCs定向肝細胞、肺細胞、胰島細胞等方向分化均需要先分化為定型內胚層細胞（definitive endoderm cells）。定型內胚層經典的分化方法用時3天，因分化過程中添加高濃度的活化素A（100 ng/ml，Activin A），會導致分化的同時細胞大量死亡。為提高細胞存活率，通常會添加一定濃度的血清。但血清成分復雜，提高細胞存活率的同時也嚴重影響分化效率（使用血清后流式檢測定型內胚層細胞標志物SOX17及FOXA2往往低于50%）。這也最終導致肝細胞、肺細胞、胰島細胞等終末分化細胞分化效率更低，難以滿足下游實驗的需求。本產品主要針對定型內胚層分化過程中細胞大量死亡和血清導致的分化效率低下進行產品優化，最終形成了成分確定且無血清的改良配方，明顯降低了誘導過程中的細胞死亡率，且誘導后流式/免疫熒光檢測定型內胚層細胞標志物SOX17及FOXA2陽性率大于90%。

操作方法

實驗準備

• *誘導培養基準備：

• *誘導培養基解凍：室溫解凍*誘導培養基（RC200123）。融化后輕輕充分搖勻，分裝或直接以使用。分裝后立即存儲于-80 ℃，避免反復凍融。

• 室溫解凍有利于保護培養基中營養物質不被破壞，切不可置于37℃水浴劇烈解凍，解凍后請務必充分混勻，以保證成分的均勻。

• 使用前準備：*誘導培養基使用前必須進行室溫復溫。

• 解凍后的*誘導培養基必須充分混勻，2-8℃保存。整個過程確保無菌操作，試劑開封前以75%酒精擦拭表面。*誘導培養基使用前置于室溫環境復溫，該操作適用于所有用到*誘導培養基的步驟。

• 自備試劑：

• 多能干細胞*培養基

• 細胞消化液

• 無鈣鎂的磷酸鹽緩沖液（DPBS）

操作方法

1. 待分化細胞接種：分化前一天消化，接種hESCs/iPSCs。以24孔板進行誘導分化為例，確保分化開始加入*誘導培養基時細胞匯合度大于90%，細胞貼壁時間大約為12-16小時。

2. hESCs/iPSCs 復蘇后狀態較差，建議傳代數次調整細胞狀態后種板開始誘導分化，建議傳代3次后開始種板誘導分化。細胞狀態和細胞培養中需要注意的細節，細胞消化、離心時間等可參考多能干細胞相關產品（RC200120、RC200121、RC200111）的產品說明書。

1. 誘導起始：棄去培養上清，用*誘導培養基輕柔地洗滌細胞2次。按照培養器皿的參考培養基添加量加入*誘導培養基。將器皿放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的細胞培養箱進行培養。*誘導培養基的參考添加量為24孔板500 μl/孔、6孔板2 ml/孔、10 cm培養皿15 ml/皿。

3. 再次特別提醒*誘導培養基使用之前必須復溫。加入*誘導培養基之前必須經過*誘導培養基洗滌，否則會影響細胞分化。洗滌時盡量*去除胚胎干細胞的培養基殘留，建議洗滌體積24孔板1 ml/孔、6孔板2 ml/孔、10 cm培養皿8 ml/皿。

1. 換液誘導：誘導24小時后，倒置顯微鏡觀察細胞。更換新鮮*誘導培養基。將器皿放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的細胞培養箱繼續培養。每天換液，繼續誘導至72小時。

4. 誘導培養會對細胞進行篩選，細胞死亡為正常現象。經過72小時誘導后，細胞匯合度應大于80%。誘導培養基使用之前必須復溫，提前室溫放置復溫即可，切不可37℃水浴復溫。

1. 標志物檢測：經過72小時誘導，細胞匯合度大于80%。定型內胚層細胞呈三角形或多角形，流式細胞術檢測SOX17陽性率應大于90%。

5. 該誘導終點只是其他實驗的起點，誘導終點的細胞難以長時間穩定在該狀態，需要盡快進入后續實驗（大于72小時細胞會出現凋亡，因此需要每天固定時間點進行實驗），如肝臟細胞、胰島細胞、肺細胞等的誘導分化程序等。

6. 以上所有操作均在無菌細胞培養室進行，細胞開放操作要在生物安全柜內進行；該研究常用的培養器皿包括培養皿、培養板，也可自行設計方案使用細胞培養瓶、細胞工廠等，請根據實驗需要自行選擇；多能干細胞的初始狀態對分化的成功至關重要，請務必保證初始細胞未分化。該試劑盒僅用于多能干細胞向定型內胚層分化的研究，用于其他研究時該操作規程僅作為參考。

細胞形態展示：

鑒定結果：

應用示例：

1. 人胚胎干細胞源肺類器官分化

1. 人胚胎干細胞源肝細胞分化

參考文獻

1. Chen, Y; Feng, J; Zhao, S; Han, L; Yang, H; Lin, Y; Rong, Z; Long-Term Engraftment Promotes Differentiation of Alveolar Epithelial Cells from Human Embryonic Stem Cell Derived Lung Organoids, Stem cells and development, 2018, 27(19): 1339-1349.

2. Li, Q; Hutchins, A. P; Chen, Y; Li, S; Shan, Y; Liao, B; Zheng, D; Shi, X; Li, Y; Chan, W; Pan, G; Wei, S; Shu, X; Pei, D; A sequential EMT-MET mechanism drives the differentiation of human embryonic stem cells towards hepatocytes, Nature communications, 2017, 8(1): 1-12.