產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱：肝類器官分化試劑盒

貨號：RC200128

批號：見包裝

試劑清單：

存儲與有效期：

組分1、2、3于-20至-80 ℃避光保存，組分4于2-8 ℃避光保存。組分1、2、3必須避免反復(fù)凍融；首ci*解凍后可以按使用量進行分裝，置于-20至-80 ℃長期保存；2-8 ℃條件下，穩(wěn)定儲存2周。

適用范圍：

本試劑盒適用于定型內(nèi)胚層細(xì)胞（SOX17⁺/FOXA2⁺細(xì)胞，詳見本公司定型內(nèi)胚層高效分化試劑盒，RC200123）進一步定向肝細(xì)胞分化，同時進行立體培養(yǎng)，形成肝類器官。

產(chǎn)品介紹

類器官與懸浮培養(yǎng)是當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用的前沿，是未來再生醫(yī)學(xué)與組織工程發(fā)展的趨勢。為適應(yīng)日益發(fā)展的科研需求，并為生命科學(xué)尤其是再生醫(yī)學(xué)研究的需要，開發(fā)優(yōu)化了相關(guān)產(chǎn)品，可以為科研工作者提供穩(wěn)定的研究平臺，以助力研究的時效性和經(jīng)濟性。該產(chǎn)品設(shè)計同時考慮再生醫(yī)學(xué)臨床前研究的需求，可以為研究人員提供大量穩(wěn)定的種子細(xì)胞，加速應(yīng)用后期技術(shù)的研發(fā)。

本產(chǎn)品無血清、成分明確、含有細(xì)胞保護因子，適合于人多能干細(xì)胞分化為定型內(nèi)胚層細(xì)胞之后進一步肝類器官的誘導(dǎo)。

操作方法

實驗準(zhǔn)備

• *培養(yǎng)基準(zhǔn)備：
• 1-3（S1、S2、S3）均為*培養(yǎng)基：2-8℃解凍。*融化后輕輕搖勻，可以按照實際使用量分裝。分裝后立即存儲于-20至-80 ℃，避免反復(fù)凍融。
• 2-8℃冰箱過夜，切不可置于37℃水浴劇烈解凍，解凍后請務(wù)必充分混勻，以保證培養(yǎng)基成分的均勻度。
• 自備試劑耗材：
  • 多能干細(xì)胞*培養(yǎng)基
  • 定型內(nèi)胚層高效分化試劑盒（RC200123）
  • 低黏附培養(yǎng)板
  • 細(xì)胞消化液（RegenTASE Ⅰ，RC200111）
  • 細(xì)胞固定液（2-4%中性多聚甲醛溶液）

操作方法

1. 定型內(nèi)胚層細(xì)胞消化：人多能干細(xì)胞提前分化為定型內(nèi)胚層細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基（RC200128-4），培養(yǎng)基加入量約2 ml/孔（六孔板），輕柔洗2次。棄去培養(yǎng)基，加入適量細(xì)胞消化液（RC200111），消化液加入量約1 ml/孔（六孔板），37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3-5分鐘。顯微鏡下觀察，待細(xì)胞邊緣發(fā)亮、回縮（細(xì)胞未漂起），小心吸棄消化液，加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基輕柔吹打。收集細(xì)胞，200 g離心3-5分鐘。
2. 該試劑盒從定型內(nèi)胚層細(xì)胞起始，定型內(nèi)胚層細(xì)胞誘導(dǎo)方法見定型內(nèi)胚層高效分化試劑盒，RC200123。
   2. S1階段-肝前體類器官誘導(dǎo)分化：S1*培養(yǎng)基（RC200128-1）提前置于室溫復(fù)溫后放置到超凈工作臺備用。步驟1消化、離心收集的細(xì)胞小心棄去上清液，用適量S1*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于低黏附培養(yǎng)板，接種量約為5X10⁵細(xì)胞/孔，培養(yǎng)基量為3 ml/孔（六孔板）。懸浮培養(yǎng)，推薦每天半量換液。每次換液前輕柔旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，做離心運動，使細(xì)胞匯聚于孔中間區(qū)域，換液時輕柔沿孔邊緣吸液。S1階段持續(xù)4-5天。
3. 以上操作方案以六孔板為例，若使用其他器皿可以根據(jù)需要自行調(diào)整方案。調(diào)整方案時建議以細(xì)胞密度為穩(wěn)定因素。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO₂、飽和濕度。所有培養(yǎng)基在使用前必須進行室溫復(fù)溫。這些注意事項同樣適用于以下步驟。
   3. S2階段-胎肝類器官誘導(dǎo)分化：巴氏吸管吸取、收集S1階段培養(yǎng)物，50 g離心3-5分鐘。棄去上清，加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基（RC200128-4）重懸培養(yǎng)物，50 g離心3-5分鐘。棄去上清，加入適量S2*培養(yǎng)基（RC200128-2）繼續(xù)誘導(dǎo)分化。每天半量換液，方法及加入培養(yǎng)基量同前S1階段。S2階段持續(xù)6-8天。
4. 吸取培養(yǎng)物時務(wù)必要用巴氏吸管等口徑較大的移液材料，因培養(yǎng)物顆粒較大，不能使用1 ml等的移液槍頭，以避免對培養(yǎng)物造成損傷。培養(yǎng)物顆粒較大，離心時離心力必須小，離心沉淀松散，棄去上清時要足夠輕柔。培養(yǎng)物重新懸浮時也要盡量輕柔。
   4. S3階段-成熟肝類器官誘導(dǎo)分化：巴氏吸管吸取、收集S2階段培養(yǎng)物，50 g離心3-5分鐘。棄去上清，加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基（RC200128-4）重懸培養(yǎng)物，50 g離心3-5分鐘。棄去上清，加入適量S3*培養(yǎng)基（RC200128-3）繼續(xù)誘導(dǎo)分化。每天半量換液，方法及加入培養(yǎng)基量同前S1階段。S3階段持續(xù)8-10天。
5. 該部分注意事項同S2階段。該階段完成后的培養(yǎng)產(chǎn)物即為成熟肝類器官，可用于相關(guān)研究。S2、S3階段可收集部分培養(yǎng)物檢查肝系各標(biāo)志物表達(dá)，樣品推薦冰凍切片行免疫熒光染色，樣品離心收集后，DPBS洗一次，用適量樣品固定液進行固定，安排后續(xù)包埋、切片及染色。
6. 以上所有操作均在無菌細(xì)胞培養(yǎng)室進行，細(xì)胞開放操作要在生物安全柜內(nèi)進行；該研究常用的培養(yǎng)器皿包括培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板，也可自行設(shè)計方案使用細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞工廠等，請根據(jù)實驗需要自行選擇；細(xì)胞的初始狀態(tài)對分化的成功至關(guān)重要，請務(wù)必保證初始細(xì)胞的可靠性。該試劑盒僅用于定型內(nèi)胚層細(xì)胞向肝臟類器官分化的研究，用于其他研究時該操作規(guī)程僅作為參考。

誘導(dǎo)過程示圖例及結(jié)果展示圖：

A：本試劑盒誘導(dǎo)肝類器官過程示意圖；B：各階段明場圖；C-E：肝系、上皮及功能性標(biāo)志物檢測；F：HE染色觀察形態(tài)、結(jié)構(gòu)；G：肝細(xì)胞低密度脂蛋白轉(zhuǎn)運功能測試。