人間充質干細胞成脂誘導試劑盒

僅用于科學研究

產品信息

產品名稱：人間充質干細胞成脂誘導試劑盒

貨號：FY200007

批號：見包裝

存儲與有效期：

組分A、D、E于2-8 ℃避光保存，組分B、C于-20 ℃避光保存。所有組分均須避免反復凍融及復溫，各組分在所需要的溫度下有效期為1年，配制完成的*培養基于2-8 ℃保存，有效期1個月。

適用細胞：

人骨髓間充質干細胞、人脂肪間充質干細胞、人臍帶間充質干細胞、人羊膜間充質干細胞、人牙髓間充質干細胞、人臍帶血間充質干細胞，其他組織來源的人間充質干細胞。

產品介紹

間充質干細胞（MSC）具有多向分化的潛能，體外在一定條件下可以誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞。2006年國ji細胞治療協會（ISCT）確定此三項檢測指標是MSC鑒定的必檢項目，目前以MSC為基礎的研究報道均會對該三個指標進行鑒定。在多種組織來源和制作方法的MSC藥品質量控制中，成骨、成脂、成軟骨也是必檢指標。

為滿足科研和制藥對MSC分化能力的鑒定，弗元生物結合多年MSC研究經驗優化MSC誘導試劑盒，在穩定性、易用性上大幅改進，采用了精心設計的小包裝。該試劑盒的設計用途，首先，用于鑒定人MSC是否具有成脂分化能力，滿足MSC質量控制的要求。其次，誘導培養基還可用于研究誘導分化過程中的其他檢測，如mRNA檢測、lncRNA檢測、microRNA檢測、蛋白表達檢測、油脂定量檢測、免疫組化檢測等。再者，該產品誘導MSC分化為的脂肪細胞多為多泡脂肪細胞樣，當脂肪滴融合過大時容易脫壁，難見單泡脂肪細胞樣。用于脂肪研究可斟酌使用本產品。

本產品僅適用于科學研究。

操作方法

實驗準備

• 試劑配制：
• B：2-8℃過夜融化添加物B液，B液使用前須37℃復溫30分鐘，充分混勻。將基礎培養基A液平均分成2份，各45 ml，加入添加物B液配制成*誘導培養基B，充分混勻。
• C：2-8℃過夜融化添加物C液，加入基礎培養基A液的另一份45 ml，配制成*誘導培養基C，充分混勻。
• 添加物B液必須充分復溫，內容物充分解凍為透明無沉淀。混合成誘導*培養基后必須充分混勻，2-8 ℃保存。整個過程須確保無菌操作，各試劑開封前以75%酒精擦拭表面。
• O染液（工作液）：取油紅O儲液，與蒸餾水以3：2的比例混合均勻，中性濾紙過濾，即配制成了油紅O染液（工作液）。
• 培養皿處理：
• D液到培養器皿中，輕輕搖動使其覆蓋整個培養器皿底面，室溫靜置30-60分鐘。棄去溶液，室溫晾干。
• 包被液C使用前必須進行室溫復溫。建議使用六孔板，每孔加D液1 ml，使用其他培養器皿時需考慮實驗結果的穩定性。整個過程需在超凈工作臺中操作，避免污染。
• 自備試劑：
  • 消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 ）
  • 磷酸鹽緩沖液（DPBS）
  • MSC*培養基
  • 4%中性多聚甲醛溶液
• 若MSC*培養基不含血清，則需要準備胰酶抑制劑。MSC消化極易過度，建議稀釋0.25%胰酶消化液一倍，且嚴格控制消化時間。

操作步驟

1. 準備所需誘導分化的MSC，當細胞融合達85%左右時，用消化液消化細胞，并用MSC*培養基重懸。
2. 按照3×10⁴ cells/cm²的密度將細胞接種于已包被處理的六孔板中，每孔MSC*培養基2 ml，37℃、5%CO₂培養箱中培養。
3. 細胞密度為該試劑盒的標準密度，可根據實驗室情況進行調整，調整依據參照所檢測MSC正常傳代的密度的2倍接種，培養24小時后添加誘導培養*培養基；或接種密度低，待細胞生長至下一步要求的密度后進行誘導。
3. 當細胞融合達90%時，棄去培養上清，每孔添加誘導液B 2 ml/孔，37℃、5%CO₂培養。
4. 成脂誘導后細胞易脫壁，換液時*培養基必須經室溫復溫30分鐘。添加培養基時動作要輕柔，沿培養器皿側壁緩緩加入，避免吹起細胞。細胞起始誘導融合度對誘導效果十分關鍵，必須確保細胞生長至足夠密時再進行誘導。
4. 誘導培養72 小時后棄去原培養上清，添加誘導液C 2 ml/孔，37℃、5%CO₂繼續培養。
5. 繼續誘導培養24 小時后棄去原培養基，添加誘導液B 2 ml/孔，37℃、5%CO₂繼續培養。
6. 重復步驟4、5約3-5次，待細胞內出現明顯脂滴時更換為誘導液C繼續培養。
7. 注意：一般在培養4天左右高倍鏡下能看到細胞漿內有較多數量的圓形亮泡，5-9天融合為較大的亮泡，這些結構圍繞在細胞核周圍，較大的與細胞核大小相當。狀態較好的細胞10天內可結束培養過程，若10天后仍未見脂滴結構，請注意分析操作步驟與其他原因。
8. 每2天更換新鮮誘導液C，繼續培養至脂滴足夠大時培養結束。
9. 換液時誘導液必須經過復溫，否則影響誘導效果和可能導致細胞脫壁。根據實驗需要選擇培養結束時間，若成脂面積過大或脂滴過大導致連成片則不利于結果的呈現，建議提前終止。不同實驗室MSC誘導時出現脂滴的時間不盡相同，若大面積出現脂滴較早，則可提前更換為誘導液C。
9. 誘導培養結束時，棄去培養上清，DPBS洗細胞兩次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/孔室溫固定細胞20分鐘。
10. 培養結束時或中途可以選擇其他檢測方法，如基因表達檢測等，若采用自己的檢測方法則后續方案需要自己擬定。
10. 棄去固定液，DPBS洗2次，加入油紅O染液（工作液）1 ml/孔染色15分鐘。
11. 該步驟適用于鑒定成脂能力，若出現脂滴（脂肪細胞）則會呈現紅色著色。若需要得到美觀的圖片，則染色時間需自己掌握。
11. 棄去油紅O染液（工作液），DPBS洗3次。
12. 染色后肉眼可見孔內明顯染紅。染色過程中一定要避免組織細胞被風干，風干會影響顯微觀察效果。
12. 顯微鏡下觀察并拍照。
13. 拍照一般選用高倍鏡，請根據需要確認選擇。
13. 結果判定：按照程序操作完畢，低倍鏡下觀察可見大面積紅色著色點，20倍和40倍鏡下可觀察到紅色球形在細胞內的情況，此紅色著色球為脂滴，說明實驗所用的MSC具有成脂能力。否則，所使用的MSC無成脂能力。
14. 該判定標準僅進行定性分析，若需要進行定量分析，需要自行制定方案。