產品信息

產品名稱：人間充質干細胞無血清培養基

貨號： RC200101

批號：見包裝

試劑清單：

存儲與有效期：

組分A于2-8 ℃保存，組分B于-20 ℃保存。所有組分均須避免反復凍融及復溫，各組分在所需要的溫度下有效期為1年，配制完成的*培養基于2-8 ℃保存，穩定儲存2-3周。

適用細胞：

適用于人骨髓、脂肪、臍帶等組織來源的間充質干細胞的原代分離、擴增與傳代培養。

操作方法

實驗準備

• 人間充質干細胞*培養基配制：
• 添加劑處理：37℃快速解凍人間充質干細胞培養基添加劑（RC200101-B），快速溶解有利于保護添加劑中營養物質不被破壞，時間約為10分鐘。添加劑融化后輕輕充分搖勻，分裝或直接按比例添加到基礎培養基中，分裝后添加劑立即存儲于-20℃至-80℃，避免反復凍融。
• 剛融化的培養基添加劑可能會有溶解不充分，出現類似沉淀物，請務必充分混勻，以保證添加的均勻度。
• *培養基配制：將添加劑以10%比例加入到人間充質干細胞基礎培養基（RC200101-A）中，充分混勻，即配制成人間充質干細胞*培養基（RC200101）。*培養基在2-8℃可穩定儲存2-3周，超過3周的*培養基請謹慎使用。
• 混合成人間充質干細胞培養基后必須充分混勻，2-8 ℃保存。整個過程確保無菌操作，各試劑開封前以75%酒精擦拭表面。*培養基使用前務必室溫復溫30分鐘。
• 自備試劑：
  • 消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他）
  • 磷酸鹽緩沖液（DPBS）
  • 細胞凍存液

操作方法（參考，請根據各自實驗需求自行制定操作規程）

• 原代細胞培養（羊水、全血、全骨髓培養發法、酶消化法）：
  1. 該部分以單細胞懸液為操作起始。單細胞獲取方式包括但不限于使用胰酶、膠原酶、分散酶等酶消化法從脂肪、臍帶、羊膜、皮膚等組織獲得；使用離心法直接從羊水、全血、全骨髓獲得。
  2. 原代接種：以上方法獲得的細胞沉淀，漩渦震蕩使其分散為單個細胞，加入適量的*培養基，充分混勻。200 g離心5-10分鐘。棄去上清，漩渦震蕩使沉淀分散為單個細胞，加入適量的*培養基，充分混勻。按照一定的細胞密度接種與培養器皿中。37℃、5%CO₂、飽和濕度靜置培養48小時。該時間段內請勿移動培養器皿，也無需觀察。48小時后觀察細胞，根據情況選擇半量或全量更換新鮮*培養基。
  3. 換液培養：后每48小時更換新鮮培養基。觀察細胞，棄去原培養上清。若懸浮細胞較多，則可用DPBS輕輕洗滌細胞1-2次。添加新鮮*培養基繼續培養。
  4. 傳代：原代細胞傳代以克隆大小和克隆中心細胞密度為標準。若克隆中心細胞密度較大，則不論整個培養器皿是否長滿均應進行傳代操作。棄去培養上清，加入適量的DPBS，輕輕晃動后棄去DPBS，重復洗滌2-3次。加入適量的0.25%胰蛋白酶消化液室溫消化2分鐘，加入2倍體積的*培養基終止消化。用移液管、吸管、移液槍頭等輕輕吹打細胞，使其從培養皿表面脫落。
  5. 凍存：參照下述“hMSC細胞凍存”。
• 原代細胞培養（組織塊法）：
  1. 該部分以組織塊作為起始。組織塊包括但不限于臍帶、羊膜、皮膚等來源的切成1-3 mm³大小的組織塊。
  2. 原代接種：用緩沖液清洗過的組織塊，用適量的*培養基懸浮，300目無菌濾網過濾或200 g離心5-10分鐘，收集組織塊。用適量的*培養基重新懸浮組織塊，均勻接種于培養皿中，37 ℃、飽和濕度、5%CO₂靜置培養。48小時內最hao不要對培養器皿進行任何移動。
  3. 換液：48小時后進行半量換液或全量換液，具體視情況而定。每2天更換新鮮培養液。組織塊周圍有密度較高的細胞時，可以選擇去除組織塊。
  4. 傳代：參照上述“傳代”方法。
  5. 凍存：參照下述“hMSC細胞凍存”。
• hMSC細胞傳代培養（非原代）：
  1. 在顯微鏡下觀察細胞，當細胞融合度達到90%，即可傳代。
  2. 棄掉培養上清，加入DPBS溶液清洗1次，加入細胞消化液使之*覆蓋培養器皿底部。
  3. 室溫孵育1分鐘，輕輕拍動培養器皿，顯微鏡下觀察大部分細胞從培養器皿底部脫落后立即停止消化。
  4. 加入消化液2倍體積的人間充質干細胞*培養基，用移液器輕輕吹打瓶壁上未*脫離的細胞，使細胞*脫落并均勻分散。
  5. 將細胞懸液轉移到離心管中，200 g離心5分鐘。
  6. 棄上清，加入人間充質干細胞*培養基，重懸細胞，計數。1：3-1：6比例傳代，均勻鋪在培養皿/瓶中，置于37℃，5%CO₂培養箱中培養。
• hMSC細胞復蘇：
  1. 從液氮中取出凍存的hMSC細胞，迅速將凍存管/凍存袋放入復蘇裝置或37℃水浴快速融化。
  2. 將解凍后的細胞懸液緩慢加入適量已復溫的人間充質干細胞*培養基（凍存體積與培養基的體積比為1：5-1：10）。
  3. 200 g離心5分鐘，吸掉上清，加入適量的人間充質干細胞*培養基重懸細胞。
  4. 將細胞均勻鋪到培養器皿中，搖動培養器皿使細胞均勻分布，5%CO₂的37℃培養，24小時后觀察細胞狀態。
  5. 24小時后更換新鮮人間充質干細胞*培養基繼續培養，每2天更換培養液。
• 細胞傳代所需的時間：2-4天。hMSC消化極易過度，建議稀釋0.25%胰酶消化液一倍，且嚴格控制消化時間。
• hMSC細胞凍存
  1. 細胞達到90%匯合度，棄掉原有培養基，DPBS清洗1次。
  2. 加入細胞消化液使之*覆蓋培養器皿底部，室溫孵育1分鐘，輕輕拍動培養器皿，顯微鏡下觀察大部分細胞從培養器皿底部脫落后立即停止消化。
  3. 加入消化液2倍體積的人間充質干細胞*培養基，用移液器輕輕吹打瓶壁上未*脫離的細胞，使細胞*脫落并均勻分散。
  4. 將細胞懸液轉移到離心管中，200 g離心5分鐘，吸掉上清。
  5. 加入適量細胞凍存液，調整細胞凍存密度在1×10⁶ cells/cm₂左右，每支凍存管分裝0.5-1 ml，使用凍存袋凍存請自行根據需要選擇凍存方案。
  6. 程序降溫儀凍存，或放入凍存盒然后置于-80 ℃或直接放入-80 ℃，24小時后轉入液氮中長期保存。

• 以上所有操作均在無菌細胞培養室進行，細胞開放操作要在生物安全柜內進行；hMSC切忌消化過度，過度的消化會導致細胞快速老化，且失去部分或全部分化能力；正常條件下hMSC可傳代至15代，實驗室具體可操作的傳代次數請自行分析判斷，并建議以分化能力進行判別；該培養基只用于hMSC細胞培養，操作規程僅作為參考。

文獻引用

 趙鵬. 人VEGF基因修飾脂肪源間充質干細胞的成骨特性研究[D].南華大學,2020.

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