氧化應激/衰老整體實驗

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一、氧化應激與衰老介紹
 

 1、衰老是機體代謝過程中一個進行性的必然階段，是機體健康水平和維持自身內穩態能力的退行性改變，表現為機體對環境的適應能力減弱以致喪失。衰老始于機體發育成熟并獲得繁殖能力之后，伴隨著機體老化，組織器官功能逐漸衰退，死亡的概率增加。一般認為人的高壽限大約為120歲。

2、衰老是一個多環節的生物學過程，是多因素共同作用的結果，其機制頗為復雜，涉及到機體各個系統結構與功能的改變。這些改變可以增加生物死亡的概率，同時也往往伴隨疾病的發生。目前還沒有一種理論能解釋所有的衰老現象。有關衰老的理論頗多，如遺傳控制理論、體細胞突變理論、神經內分泌理論、免疫理論、生活速率理論、生殖與老化理論以及氧化應激理論等。盡管關于衰老有許多假說不斷被提出，但導致生物體增齡性功能改變和壽命改變的機制仍不明確，其中大多理論都是建立在生物體內在衰老重要作用的基礎之上，而環境因素對衰老的發生發展同樣不容忽視。環境因素既包括生物體外部環境也包括生物體內部環境。氧化應激理論的提出即是考慮了環境因素對衰老的影響。

3、衰老的自由基理論同時涵蓋了損傷積累衰老理論和基因程序衰老理論。核心觀點包括以下幾點：①細胞代謝過程中不斷產生的自由基造成的細胞損傷是引起機體衰老的根本原因之一。②造成細胞損傷的自由基主要是氧自由基，而大部分的活性氧基團（ROS）主要由線粒體產生，線粒體作為細胞呼吸和氧化的中心與衰老密切相關。③在體內維持適當的抗氧化劑和自由基清除劑可以延長壽命和延緩衰老。

4、機體在遭受有害刺激時，體內活性氧（ROS）產生過多，超出了機體的清除速度，氧化系統和抗氧化系統失衡，過剩的ROS參與細胞內反應，引起氧化應激。氧化應激通過損傷DNA使維持細胞基本生理功能的基因失去表達活性，進而導致細胞衰老，從而導致組織損傷。在生物體的衰老過程中，機體組織細胞不斷產生的自由基逐漸累積，由于自由基反應能力較強，可氧化細胞中的多種物質，損傷生物膜，造成蛋白質、核酸等大分子交聯，因而影響其正常功能。此后自由基學說被HelmutSies等發展為“氧化應激假說”，該學說認為衰老過程中機體抗氧化成分的減少導致清除自由基的能力減弱，進而導致生物大分子結構損傷的增齡性累積。人體可以被理解成一個氧化與抗氧化的系統，隨著年齡增加，自由基不斷累積，機體平衡被打破，傾向氧化，進而導致了疾病與衰老。盡管以上學說存在爭議，但近年來越來越多的研究證實生物大分子的氧化與癌癥、心腦血管疾病、腎病、糖尿病、帕金森病、阿爾茲海默病等衰老相關疾病以及衰老本身密切相關，氧化應激即便不是諸多疾病的病因，也是一個重要的危險因素。

5、衰老的氧化應激理論認為，活性氧造成的DNA損傷是衰老的誘發事件。在衰老過程中一方面自由基的生成速率可能增加，另一方面機體氧化與抗氧化水平失衡。氧化應激對DNA的氧化損傷在正常代謝狀況下以很高的頻率發生，氧化應激導致DNA損傷易發生的部位是堿基中的胸腺嘧啶和鳥嘌呤。
6、近來一種新的漸進性的ROS衰老理論被提出：衰老早期階段，衰老相關的DNA損傷產生低劑量ＲOS，由于體內的抗氧化體系這些ＲOS并不會引起機體損傷，反而會觸發機體保護性的壓力應激反應，延緩衰老。當年齡增加，衰老相關的DNA損傷在體內持續聚集，ROS大量產生，超過了機體的清除能力，這些蓄積的ROS進一步造成DNA損傷，加劇衰老相關性DNA損傷，加速細胞的衰老，造成惡性循環。

二、氧化應激與自由基的聯系

 1、氧化應激是指機體在內外環境有害刺激的條件下，體內產生活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）所引起的細胞和組織的生理和病理反應。ROS有超氧陰離子（O2-）、羥自由基（OH-）和過氧化氫（H2O2）等等；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和過氧亞硝酸鹽（ONOO-）等等。

2、自由基的危害與作用
  1）危害：它們可以直接或間接氧化或損傷DNA、蛋白質和脂質，可誘發基因的突變、蛋白質變性和脂質過氧化，被認為是人體衰老和各種重要疾病如腫瘤、心腦血管疾病、神經退行性疾病（老年癡呆）、糖尿病------主要的危險因子，是人類健康的大敵！
  2）作用：生物氧化，氧化還原反應是人體基本的生化反應，氧化應激亦是人體一種基本的保護機制。在我們體內，每一個細胞一天要產生2.5X1011個分子的ROS，人體內每天可產生4X1021個分子的自由基。它們不僅為我們提供和傳遞為維持生命活動的能量，幫助我們消滅細菌和病原體，清除體內的毒素和“垃圾”。所以氧化應激和自由基亦是我們的朋友我們人體不能沒有，也不能“消滅”它！
  3）簡述抗氧化系統中一些簡單的自由基清除劑及產物
   （1）超氧化歧化酶（SOD），SOD它可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因為自由基造成的對細胞傷害。

   （2）過氧化氫酶（CAT），CAT它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內的過氧化氫，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，因為H2O2會與O2在鐵螯合物作用下反應生成非常有害的-OH。
   （3）谷胱甘肽過氧化酶（GSH－Px），GSH-Px它為生物體中清除過氧化氫和其他有機過氧化物的脫毒酶以保護細胞膜結構和功能完整性的作用
   （4）丙二醛（MDA），MDA是自由基發生反應的產物，促進機體衰老。生物體內，自由基作用于脂質發生過氧化反應，氧化終產物為丙二醛，這回會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，且具有細胞毒性 。

三、氧化應激的相關檢測方法
1、抗氧化酶類的檢測
  1）超氧化物歧化酶(SOD)的檢測
  SOD活力的高低與自由基、低密度脂蛋白的氧化損傷有著密切的聯系,測定SOD的活力可間接反應組織細胞抗氧化損傷、機體清除自由基的能力。SOD體外活性測定方法有直接法和間接法,包括電泳法、免疫法、ESR法、化學發光法、脈沖輻解法、紫外分光光度計法等。
  2）谷胱甘肽過氧化物酶的測定 
  谷胱甘肽過氧化物酶催化GSH氧化生成GSSG,用掉一個過氧化氫。在氧化應激條件下,細胞中過氧化氫濃度明顯減少,因此測定GSH過氧化物酶的活力可以作為衡量細胞抗氧化水平的一項生化指標。可采用紫外分光光度計法、分光光度法或者酶聯免疫吸附法等進行測定。
  3）過氧化氫酶的測定
  過氧化氫酶作用于過氧化氫的機制實質上是過氧化氫的歧化,必須有兩個過氫化氫先后與過氧化氫酶相遇且碰撞在活性中心上,才能發生反應。過氧化氫濃度越高,分解速度越快。一般也采用紫外分光光度法對其進行檢測。

2、脂質過氧化損傷的測定
ROS攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸,引發脂質過氧化作用,并因此形成脂質過氧化,如醛基丙二醛、酮基、羥基氫過氧基以及新的氧自由基等。丙二醛會引起細胞損傷，因而測定丙二醛的量常常可反映機體內脂質過氧化的程度,間接反映出細胞損傷的程度。常用硫代*酸法來測定丙二醛含量,此法是應用多也是古老的方法。

3、蛋白質氧化損傷的檢測
蛋白質的氧化損傷不僅包括對酶、受體和載體蛋白的損傷,而且還包括一些二次損傷,如DNA修復酶的損傷。目前,蛋白質氧化使用廣的生物標志物是蛋白質羰基含量，其傳統的檢測技術是使用二硝基苯肼的比色法,使用分光光度法或者酶免疫吸附法測定2, 4-二硝基苯肼與蛋白質羰基反應生成的腙,來衡量蛋白質的損傷情況。一般采用Western blotting或者RT-PCR（逆轉錄聚合酶鏈式反應）來分析蛋白質含量以及蛋白表達情況。

4、氧化損傷致細胞凋亡相關基因的檢測

  1）Bcl-2基因的檢測 
  Bcl-2蛋白的上調表達可以對抗細胞的凋亡,在ROS誘導細胞凋亡的調節中,Bcl-2發揮了重要作用，Bcl-2可以減少氧自由基的產生。Bcl-2的過度表達能阻抑多種凋亡相關基因的表達。測定方法主要有印跡雜交和實時熒光定量法對它進行檢測。隨著近年來熒光定量聚合酶鏈反應術的發展，用定量聚合酶鏈反應技術來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確。
  2）p53基因的檢測
  p53基因屬抑癌基因,是細胞生長周期中負調節因子,與細胞周期的調控、DNA的修復、細胞分化、細胞凋亡等功能相關。氧化應激導致細胞DNA損傷的過程必須有p53參與。常采用免疫組織化學、原位雜交等方法來檢測。