天狼猩紅（Sirius Red）染色

一、天狼猩紅（Sirius Red）染色簡介
利用膠原蛋白聚合及其纏繞螺旋排列不同的特點，使用天狼星紅苦味酸染色法，在偏振光顯微鏡下，可以根據雙折光性和著色的不同，分別顯示出四型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）膠原纖維。區分并定量這四種膠原纖維，對于研究病變的發生機理和演變過程有一定的意義。

二、試劑配制

1、天狼星紅-飽和苦味酸液：0.5%天狼星紅10ml，苦味酸飽和水溶液90ml。

2、天青石藍液：天青石藍B 1.25g，鐵明礬1.25g，蒸餾水250ml。溶解煮沸，冷卻后過濾，加入甘油30ml，然后再加入濃硫酸0.5ml（硫酸一定要后加入）。

三、染色步驟

1、石蠟切片脫蠟至水。

2、天青石藍液5~10min

3、蒸餾水沖洗3次

4、天狼星紅飽和苦味酸液15~30min（可用Harris蘇木素液淡染細胞核）

5、無水乙醇分化與脫水。

6、 二甲苯透明、光學樹膠封固

7、結果：

  1）普通光鏡觀察：膠原纖維呈紅色，細胞核呈綠色，其他成分呈黃色。

  2）偏振光顯微鏡下觀察：

  3）Ⅰ型膠原纖維：紅色或黃色，排列緊密，具強雙折光性

  4）Ⅱ型膠原纖維：多種色彩，疏松網狀、弱雙折光性

  5）Ⅲ型膠原纖維：綠色、細纖維、弱雙折光性

  6、Ⅳ型膠原纖維：淡黃色、弱雙折光性（基膜成分）

四、樣本說明

1、石蠟切片

取材：1、組織離體后需及時固定；2、組織標本不宜過大、過厚。

固定：1、固定液：10%福爾馬林（4%多聚甲醛）或10%中性甲醛；2、用量：一般固定液的量與組織體積比為10:1～20:1；3、固定：適宜的固定時間，主要根據材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。

保存：切片經60℃烤片3-5小時后，可于常溫或4℃干燥保存。
 

2、冰凍切片

取材：取材后需立即置于超低溫冰箱或液氮中保存。

固定：樣本冰凍切片后，應立即放入甲醇、丙酮、95%酒精、4%多聚甲醛等固定液中固定。

保存：固定好的切片自然風干，密封后置于-80℃、-20℃保存，盡快用于后續實驗。
 

3、細胞塊石蠟切片

細胞量較多的樣品，可離心分離所需細胞，用中性甲醛固定后制作成瓊脂細胞塊，然后按照制作石蠟切片的操作流程進行切片。
 

4、細胞爬片

在孔板里做的細胞爬片，爬片取出后，用PBS洗滌2次（根據研究目的，PBS洗滌可選擇不做），用4%多聚甲醛4℃固定15分鐘，將表面液體吹干，置于-20℃保存。若在短時間內即開展實驗，可在加固定液后，于4℃冰箱中放置一段時間。
 

5、細胞涂片

細胞涂片常用的固定液有95%酒精（為常用）、酒精-冰醋酸液、Ethyl ether-酒精液和Carney’s液等。 

五、免疫組化實驗注意事項

1、常用的固定液為中性甲醛和4%多聚甲醛，能使大多數抗原保存良好，適用于免疫組織化學。

2、病理實驗切片Best是防脫片，以免實驗過程中出現掉片。若客戶提供切片，應告知切片有無防脫處理。

3、骨組織、皮膚組織或脂肪含量較高的樣本，實驗過程中有較高的掉片幾率。

4、客戶可提供組織塊（以10%福爾馬林、4%多聚甲醛或10%中性甲醛固定，如組織塊極小請事先說明）、蠟塊或切片（使用免疫組化切片，以避免實驗過程中掉片）

5、待檢測蛋白的種屬、實驗分組情況及實驗背景資料、其他具體要求等需事先說明。

6、若客戶提供骨組織或鈣化程度較高的組織進行實驗，需進行脫鈣處理。

7、浸泡在固定液中的組織樣本，在運輸中容器需密封，防止破碎、滲漏。