CRISPR/Cas9整體實驗服務

1、提供項目CRISPR/Cas9整體實驗方案：客戶根據課題標書及需做實驗的主體內容，擬定并提供初步的項目方案，含課題申請書，實驗方案，實驗設計，實驗思路，實驗文獻等與實驗相關等內容和資料。或者由嘉美實驗協助實驗委托者完成CRISPR/Cas9整體實驗方案的設計。
2、項目評估報價：公司技術團隊根據客戶提供的相關資料，綜合評估項目可行性，與客戶共同確定準確的實驗項目執行方案，給出準確的實驗價格。嘉美實驗協助設計的課題直接給出準確的報價。
3、簽訂服務協議：簽署服務協議并預付部分費用，做好實驗初步準備及項目預安排。
4、執行服務項目：正式啟動實驗進程，全面展開實驗，確保項目有效執行。
5、溝通項目進展：及時溝通反饋實驗的Newest進展，隨時了解掌控實驗的Newest動態。
6、完成項目交付：支付剩余尾款，交付實驗結果，正確應用實驗結果，提供售后服務。

一、嘉美實驗構建的CRISPR/Cas9 基因編輯穩定細胞株案例的實驗步驟
 

嘉美實驗擁有完善的 CRISPR/Cas9 載體系統，包括單敲除，雙敲除，缺口酶、慢病毒敲除載體和敲除載體庫等體系。并且每一個載體系統都有不同的標簽（EGFP/RFP/Puro/Neo）可供選擇。同時，擁有 100 余種基因敲除的項目經驗，可以快速、準確、高效的完成任何一個基因敲除的項目。

1、設計針對 Atg10基因的 gRNA并克隆到嘉美實驗的 pGK1.1敲除載體中；
2、電轉 pGK1.1（Atg10）載體至 K562細胞中；

3、Cruiser™酶切計算突變率（圖1）；

4、單克隆篩選用 Cruiser™酶切驗證獲得潛在陽性克隆（圖2）；

5、對潛在的陽性克隆進行測序驗證，獲得純合子；

圖1. Cruiser™酶切細胞池，計算突變率。

圖3. 潛在陽性克隆測序比對結果
根據潛在陽性克隆單克隆測序驗證結果，判斷該株疑似陽性克隆的兩個親本都缺失11bp堿基，該株陽性克隆為純合子敲除細胞株。

 

二、CRISPR-Cas系統介紹

CRISPR-Cas系統 The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats-associated protein systems）是一個細菌及古細菌進化出來用以抵御病毒和質粒入侵的適應性機制。CRISPR-Cas系統的高效基因組編輯功能已被應用于多種生物，包括斑馬魚、小鼠、大鼠、秀麗隱桿線蟲、植物及細菌。多個科研小組的研究都顯示，與鋅指核酸酶（ZFNs）和轉錄激活樣效應核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比較，CRISPR-Cas系統介導的基因組靶向實驗在細胞或斑馬魚中具有相似甚至更高的效率。
 

在 II型CRISPR系統 中，CRISPR RNA（crRNA）與轉錄激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的復合物能特異識別基因組序列，引導Cas9核酸內切酶在目的片段生成DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks, DSBs）。 這個識別復合體可以通過融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA（single-guided RNA）進行簡化。基因組的靶序列中有長約20bp的片段與crRNA或sgRNA互補配對；靶序列末端的三核苷酸區域PAM（5’-NGG-3’）為Cas9識別位點，是實現剪切功能的關鍵。

CRISPR-Cas9體系 的RNA-DNA識別機制為基因 組工程研究提供了一項簡便而強大的工具。該體系其中一個重要的優勢是Cas9蛋白可在多個不同的gRNA的引導下同時靶向多個基因組位點

圖 1. CRISPR/Cas9介導的基因組編輯原理圖
 

圖2. CRISPR-Cas9介導的基因編輯。
（左）：sgRNA引導Cas9核酸酶作用于基因組，形成的DSBs被非同源末端連接（NHEJ）機制修復；
（右）：sgRNA引導Cas9核酸酶作用于基因組，形成DSBs，同源重組（HR）作用下，供體質粒上的目標基因及篩選標記（或其他遺傳元件）在斷裂處被整合進基因組。
 

圖3: 切口酶在結合鏈生產單鏈切口的原理圖