DNA羥甲基化定量檢測試劑盒 （比色法）

介紹

產品特性： 在使用DNA羥甲基化定量檢測試劑盒（比色法）檢測全基因組DNA羥甲 基含量時是非常適合的.不論是從哺乳類動物,植物,真菌,細菌,病毒和培養細 胞,新鮮與冷凍的組織,石蠟包埋組織,血漿/血清樣本,體液樣本. 此品尤其適 合僅有少量樣品在激光顯微捕獲了的解剖樣品和胚胎.

DNA輸入量： 每次DNA的上樣量為50- 200ng。*DNA的輸入量為200 ng,hmDNA 一般都小于0.6%的總DNA。

材料： 材料包括各種組織或細胞試樣如細胞培養瓶或酶細胞、新鮮和冷凍組織, 石蠟包埋組織、血漿/血清樣品,體液樣品等.

內控: 此品包含有陽性與陰性DNA對照。一個標準曲線可以進行(范圍:1－ 10ng)或單個數量的羥甲基化的DNA可以作為陽性對照。因為全基因組羥甲 基化是從組織到組織,從正常和病變的區域,建議確保運行復制樣品信號的生 成是經過驗證的。這個工具可以讓用戶以量化的數量或相對數量來確定 羥甲基化的DNA。

預防措施： 為了避免交叉污染,小心樣品或溶液的加入。在使用移液器進行加不同液 體樣本時，要及時更換槍頭。在整個實驗程序中需要戴手套。且不同樣品之 間的接觸,立即更換手套

一般特性: 質控: 每批（比色法）的生產,對既定的各個組件 的生產把控,確保了穩定的產品質量。保證所有產品的性能描述都符合行業的 產品標準。

產品概述： (比色法)中含有定量檢測全基因組羥甲基 化所必需的所有試劑。在檢測實驗中，DNA 被固定在一種有 DNA 吸附能力 的孔上，羥甲基化的片段會被捕獲劑以及檢測抗體識別，用熒光分光光度計 讀取在ex=530+/-20/em=580 +/-20nm處的熒光強度來定量。羥甲基化的DNA 的量與熒光強度值成線性關系，可以通過本試劑盒提供的方程來計算兩種不 同的羥甲基化 DNA 樣品的相對羥甲基化狀態或者通過標準曲線*定量 5-mc。基于其工作原理和微孔板模式，本試劑盒可以用于各種物種來源的多 種樣品形式，包括培養的細胞、新鮮和冷凍的組織、石蠟包埋組織、血漿/ 血清樣品以及體液樣品。

關于5-hmC 5-hmC 是近年來在動物組織中發現的，由胞嘧啶修飾而來。5-hmC 在表 觀遺傳學上的功能可能與 5-甲基化胞嘧啶(5-mC)不同。盡管到現在為止還不 確知其功能，有研究者猜測它在調控基因的表達與關閉過程中起著重要的作 用。5-mC 的發現讓我們不得不重新評估 DNA 甲基信息，也不得不監測人類 的健康組織和病理組織之間 5-mC 相對分布的差異。在我司的 DNA 羥甲基化 定量檢測技術之前，我們還沒有發現任何直接的常規方法來檢測5-hmC,以及 區分 5-hmC 和 5-mC。

5-hmC 和 5-mC 的區別 時下常用的 DNA 甲基化分析方法包括限制內切酶酶切和亞硫酸氫鹽后 的定性定量分析或 MeDIP 介導的 MS-PCR 和測序，這些技術都不適合用來 檢測 5-hmC，因為它與 5-mC 事實上很難用這類方法區分開來。為了解決這 個問題，我司特研制了DNA 羥甲基化定量檢測試劑盒(熒光法)。本試劑盒提 供了一種很經濟的方法來檢測5-羥甲基化胞嘧啶，并且區分5-hmC, 5-mC, 和 C，使得研究者能夠重新評估他們的DNA 甲基化信息，也能夠在新樣品中尋 找 DNA 羥甲基化。 zui近，一種新的修正的核苷酸被命名為：5-hmC,且在老鼠的大腦和 胚胎干細胞中已經發現。在1952 年，5-hmC *次發現是在噬菌體內。在哺

乳動物中，它是由甲基化胞嘧啶氧化所產生的，這是一個通過 T 族酶和DNA 甲基轉移酶蛋白介導的一個反應 。下面是胞嘧啶的甲基化、羥甲基化形式：

未甲基化 DNA 甲基化 DNA 羥甲基化 DNA T-C-G-T-C-G-A-C-G T-mC-G-T-mC-G-A-mC-G T-hmC-G-T-hmC-G-A-hmC-G

試劑盒曾經對來自小鼠大腦和海拉細胞系的樣品成功地進行了 5-hmC 的定 量，所得到的結果與用 HPLC 和 LC-MS 的方法相當。通過使用本試劑盒， 研究者們*在正常人類腦部組織和結腸組織中發現了高豐度的 5-hmC。同 時，研究結果還顯示，正常人類腦部組織和結腸組織中 5-hmC 分別占總甲基 化胞嘧啶(5-mC 和 5-hmC 的總和)的 32%和 16%。相反，在結腸癌細胞系 (HCT116)和宮頸癌細胞系(HeLa)中，5-hmC 的比率很低，幾乎沒有。 96孔板模式讓您可以根據自己的需要選擇用手工或者高通量；此試劑盒 中提供通用陽性和陰性對照，能用于定量檢測各種來源的 DNA 樣品中的羥 甲基化狀態，包括哺乳動物、植物、真菌、細菌以及病毒；此試劑盒中含有 定量檢測全基因組 DNA 羥甲基化實驗所有用到的試劑，包括陽性和陰性對 照。直接測定熒光強度的方法來進行定量檢測取代了已過時的和劣質的方法， 無須 DNA 消化/變性、提取，不用使用套色版，不接觸放射性材料；本品用 到的新方法和試劑使得羥甲基化 DNA 定量實驗結果精確、高度靈敏特 異，檢測極限為 10pg 的羥甲基化DNA，檢測范圍寬至10pg 到 20ng，檢 測靈敏度是 HPLC 的十倍(0·008%vs 0·08%)，不與 DNA 上甲基化或者未甲基 化胞嘧啶反應，特異檢測5-hmC。

1) 5-mC轉化到 5-hmC 大大降低蛋白質的親和力對于甲基化 DNA； 2) 5-hmC 群系通過氧化損傷或借助外源的醛式的DNMTs能夠防止參與的 DNMT目標胞嘧啶不被甲基化 3) 5-hmC可能會吸收特異性的蛋白，并致使染色質的結構發生改變或DNA 甲基化模式的改變 4) 5-hmC 分布在 40%的甲基化胞嘧啶的蒲金耶氏細胞（Purkinjecells）中, 有 10%在顆粒神經元（granule neurons）中.

本試劑盒有以下優點和特性： l 整個比色法檢測技術的操作簡單易學，方便快捷，只需要3 小時45 分鐘 就能完成實驗； l 靈敏度高,檢測極限低至40pg 羥甲基化的DNA； l 對于未甲基化和甲基化的胞嘧啶無特異性,僅對羥甲基化 DNA（5-hmC） 進行高度專一的檢測; l 通用型的陽性與陰性對照,對于任何種屬的羥甲基化 DNA 狀態進行定量 檢測是非常理想的； l 微孔板（96孔）的設計使實驗更靈活,無論對于手動還是高通量分析； l 簡單、可信和檢測實驗條件恒定。

原理/程序: (比色法)包含全基因組 DNA 羥甲基化定量的 所有試劑。在此試驗中，DNA必定會跑出經過處理后的具有高親和性的DNA 條帶。在檢測實驗中，DNA被固定在一種有DNA吸附能力的孔上，羥甲基化 的片段會被捕獲劑以及檢測抗體識別，然后使用熒光分光光度計讀RFU(相對 熒光單位)，對其進行熒光法定量。羥甲基化的DNA的量同測量的OD成比例。