總體DNA羥甲基極易定量檢測試劑盒（比色法）

介紹

產品特性： 總體DNA羥甲基極易定量檢測試劑盒（比色法）檢測全基因組DNA羥甲基含量是非常 適合的.不論是從哺乳類動物,植物,真菌,細菌,病毒和培養細胞,新鮮與冷凍的組織,石蠟包埋 組織,血漿/血清樣本,體液等樣本. 此品尤其適合僅有少量樣品在激光顯微捕獲了的解剖樣 品和胚胎。不論是單鏈DNA和雙鏈DNA，片段在200bp到全長都很適用。

DNA輸入量：     每次分析DNA的上樣量為20 - 200ng。*DNA的輸入量為100 ng,在某些種屬中，組 織樣本間的甲基化的DNA含量一般都小于0.6%的總DNA。

起始材料：     材料包括各種組織或細胞樣本如細胞培養瓶或微孔板培養的細胞、新鮮和冷凍組織,石 蠟包埋組織、血漿/血清樣品,體液樣品等

產品概述： 總體 DNA 羥甲基極易定量檢測試劑盒（比色法）中含有定量檢測全基因組羥甲基化所 必需的所有試劑。在檢測實驗中，DNA 被固定在一種有 DNA 吸附能力的孔上，甲基化的片 段會被捕獲劑以及檢測抗體識別，用酶標儀讀取在 450 nm 處的 OD 值來定量。羥甲基化的 DNA 的量與 OD 值成線性關系，可以通過本試劑盒提供的方程來計算兩種不同的甲基化 DNA 樣品的相對甲基化狀態或者通過標準曲線*定量 5-hmc。基于其工作原理和微孔板模式， 本試劑盒可以用于各種物種來源的多種樣品形式，包括培養的細胞、新鮮和冷凍的組織、石 蠟包埋組織、血漿/血清樣品以及體液樣品

相關知識擴展了解：關于 5-hmC     5-hmC 是近年來在動物組織中發現的，由胞嘧啶修飾而來。5-hmC 在表觀遺傳學上的功 能可能與 5-甲基化胞嘧啶(5-mC)不同。盡管到現在為止還不確知其功能，有研究者猜測它在 調控基因的表達與關閉過程中起著重要的作用。5-mC 的發現讓我們不得不重新評估 DNA 甲 基信息，也不得不監測人類的健康組織和病理組織之間 5-mC 相對分布的差異。在我公司的 DNA 羥甲基化定量檢測技術之前，我們還沒有發現任何直接的常規方法來檢測 5- hmC,以及 區分 5-hmC 和 5-mC。  

5-hmC 和 5-mC 的區別     時下常用的 DNA 甲基化分析方法包括限制內切酶酶切和亞硫酸氫鹽后的定性定量分析 或 MeDIP 介導的 MS-PCR 和測序，這些技術都不適合用來檢測 5-hmC，因為它與 5-mC 事實 上很難用這類方法區分開來。為了解決這個問題，我司特研制了 DNA 羥甲基化定量檢測試 劑盒(熒光法)。本試劑盒提供了一種很經濟的方法來檢測 5-羥甲基化胞嘧啶，并且區分 5-hmC, 5-mC, 和 C，使得研究者能夠重新評估他們的 DNA 甲基化信息，也能夠在新樣品中尋找 DNA 羥甲基化。     zui近，一種新的修正的核苷酸被命名為：5-hmC,且在老鼠的大腦和胚胎干細胞中已經發 現。在1952年，5-hmC*次發現是在噬菌體內。在哺乳動物中，它是由甲基化胞嘧啶氧化 所產生的，這是一個通過T族酶和DNA甲基轉移酶蛋白介導的一個反應 。下面是胞嘧啶的甲 基化、羥甲基化形式：

     未甲基化 DNA           甲基化 DNA          羥甲基化 DNA    T-C-G-T-C-G-A-C-G     T-mC-G-T-mC-G-A-mC-G  T-hmC-G-T-hmC-G-A-hmC-G  

試劑盒曾經對來自小鼠大腦和海拉細胞系的樣品成功地進行了 5-hmC 的定量，所得到 的結果與用 HPLC 和 LC-MS 的方法相當。通過使用本試劑盒，研究者們*在正常人類腦部 組織和結腸組織中發現了高豐度的 5-hmC。同時，研究結果還顯示，正常人類腦部組織和結 腸組織中 5-hmC 分別占總甲基化胞嘧啶(5-mC 和 5-hmC 的總和)的 32%和 16%。相反，在結 腸癌細胞系(HCT116)和宮頸癌細胞系(HeLa)中，5-hmC 的比率很低，幾乎沒有。

一些核苷酸的修飾改變，5-羥甲基胞嘧啶，5-甲酰基胞嘧啶，5-羧基胞嘧啶，已經被發 現在人類和小鼠的組織以及胚胎干細胞中。在哺乳動物中，這些修飾的核苷酸可通過 5-甲 基胞嘧啶的氧化反應得到，中間伴隨有 TET 酶家族介導的反應。

這條技術路線圖表明：胞嘧啶的不同存在形式在調節基因功能中發揮著關鍵的作用，其 中 DNA 羥甲基的結構和模式尤為重要。 精確和便利的檢測 5-hmC 水平，對于 DNA 在不同的生理和病理過程中的變化，變得非 常重要，尤其是癌癥。基于色譜分析技術比如：HPLC 和質譜分析法：TLC 來檢測 5-hmC。但 是，這些方法耗時，通量低，高成本。為了解決這些問題，我們的技術團隊提供了一系列羥 甲基化 DNA定量檢測的方法來定量檢測 5-hmC或羥甲基化的 DNA和更為深入的改變羥甲基 化 DNA 實驗，優化出了：總體 DNA羥甲基極易定量檢測試劑盒（比色法）。

本試劑盒有以下優點和特性： l 快速：減少的步驟，整個操作僅需要 2 小時； l 穩定性：優化的試劑盒組分，允許在做復孔時，有更大的“觸發信號”，盡量減少變化；

 l 方便性：固定的低背景噪音，從而消除了 DNA 變性和板孔的限定性； l 靈敏度：檢測下限低至 0.01%的羥甲基化 DNA，輸入量在 100ng； l 特異性：高效特異結合 5-hmC，在復孔的濃度范圍內，對于未甲基化的胞嘧啶和羥甲基 的胞嘧啶無特異性反應，僅對羥甲基化 DNA（5-hmC）進行高度專一的檢測; l 通用型：陽性與陰性對照，對于任何種屬的羥甲基化 DNA 狀態進行定量檢測是非常理 想的； l 精確性：標準的陽性對照可以得到標準曲線，可以與 HPLC-MS 相媲美，用時短，效率 高，。 l 靈活性：微孔板（96 孔）的設計使實驗更靈活，無論對于手動還是高通量分析簡單、 可信和檢測實驗條件恒始終如一。

注：基于同一樣本分 2 份來測定。

 原理/程序: （比色法）包含全基因組 DNA 羥甲基化定量檢測的所 有試劑。在此實驗中，經特殊處理且具有高親和性的DNA必定會結合在微孔板上。在檢測實 驗中，DNA被固定在一種有DNA吸附能力的孔上，羥甲基化的片段會被捕獲抗體以及檢測抗 體識別，然后使用酶標儀測出 450 nm 處的吸光值，對其進行比色法定量。羥甲基化DNA 的量同測量的OD值成比例