兔腦微血管內皮原代細胞

兔腦微血管內皮細胞分離自腦組織；腦微血管內皮細胞是血腦屏障的主要組成成分，它是組成腦微血管腔面單層扁平上皮樣細胞，能夠限制可溶性物質和細胞等從血液進入大腦，大腦微血管內皮細胞與外周內皮細胞相比具有一些相同特性。它所產生和分泌的生物活性物質對維持血管張力、調節血壓、抗血栓形成等有重要作用，在腦血管疾病的發病機制中有重要病理生理學意義。與外周內皮細胞相同，大腦微血管內皮細胞表面表達細胞粘附分子，調控白細胞進入大腦。由于微血管內皮細胞的器官特異性，內皮細胞通常取源于疾病研究的相關組織。其主要特征如下：①腦微血管內皮細胞存在許多細胞間緊密連接，產生很高的跨內皮阻抗，延遲細胞旁的通量；②腦微血管內皮細胞缺乏內皮細胞的窗孔結構，其液相物質胞飲水平較低；③腦微血管內皮細胞具有不對稱定位酶和載體介導轉運系統，從而產生“兩極分化"的表現型。

產品名稱：兔腦微血管內皮細胞

組織來源：腦

產品規格：5×10?Cells/T25培養瓶

包被條件：PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態：內皮細胞樣

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔腦微血管內皮細胞體外培養周期有限；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養，以此保證該細胞的佳培養狀態。

方法簡介

實驗室分離的兔腦微血管內皮采用膠原酶-蛋白酶混合消化法結合密度梯度離心法、后通過內皮細胞專用培養基培養篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的兔腦微血管內皮經CD31免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培 養過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養基，培養過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養。

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于 37℃培 養箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養 瓶后加少量培養基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養液后吹勻。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細胞凍存時，棄去培養基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養基終止消化，可使用血球計數板計數。