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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的人肺癌成纖維采用 - 膠原酶混合酶消化后差速貼壁制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的人肺癌成纖維經Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

細胞簡介：

人肺癌成纖維細胞分離自肺癌組織；肺癌是常見的肺原發性惡性腫瘤，絕大多數肺癌起源于支氣管粘膜上皮，故亦稱支氣管肺癌。肺癌可向四周乃至全身擴散。肺癌發病率和死亡率增長快，對人群健康和生命威脅大的惡性腫瘤之一。近50年來許多國家都報道肺癌的發病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的，女性發病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不明確，大量資料表明，長期大量吸煙與肺癌的發生有非常密切的關系。肺癌，其實不是一種病，而是幾十種病的組合，有多種亞型，多種特性；根據肺癌細胞在顯微鏡下的形態特點，可以初步分為兩種類型：小細胞肺癌(SCLC)15%和非小細胞肺癌(NSCLC)85%。這兩種類型肺癌的生長特點、擴散風險和治療方案均不相同。絕大多數肺癌是非小細胞肺癌，約占85%。它又能進一步被分為三類，分別是：腺癌，鱗癌和大細胞癌。其中腺癌是主要的類型，約占非小細胞肺癌中的50%。如果是不吸煙的女性患者，幾乎全部都是腺癌。人肺癌成纖維細胞是肺癌組織中的癌相關成纖維細胞，癌相關成纖維細胞(cancer associated fibroblast，CAF)在腫瘤微環境中的重要作用已受到廣泛的重視。該細胞通過與癌細胞的直接接觸、分泌多種因子以及對腫瘤基質的改造，促進腫瘤的發生、發展、轉移甚至耐藥性的發生。隨著研究的深入，有人提出CAF可能成為抗的新靶點。然而CAF的分化來源多樣，相應的形態和功能各異，因此深入了解CAF的分化來源有利于更全面地認識腫瘤發展的機制，為臨床治療提供理論依據，體外培養肺癌成纖維細胞對肺癌研究有重要意義。

培養信息：

培養基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態：成纖維細胞樣

傳代特性：可傳5代左右；3代以內狀態佳

消化液：0.25%

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

人肺癌成纖維細胞體外培養周期有限；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養，以此保證該細胞的佳培養狀態。

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養皿中，將細胞懸液接種于培養皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當出現棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。

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