Top-Down LC-MS/MS全流程
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訂貨量 | ≥1件 |
- 公司名稱 北京百泰派克生物科技有限公司
- 品牌 百泰派克
- 型號
- 產(chǎn)地 中國
- 廠商性質(zhì) 其他
- 更新時間 2025/7/22 10:23:42
- 訪問次數(shù) 12
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業(yè)務(wù)范圍主要圍繞蛋白和小分子代謝物檢測兩大板塊,從事蛋白質(zhì)和小分子代謝物的理化性質(zhì)分析及結(jié)構(gòu)解析等相關(guān)技術(shù)服務(wù),為客戶提供高性價比、高效率的技術(shù)服務(wù)。
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Top-Down LC-MS/MS全流程解析:如何實現(xiàn)高效蛋白質(zhì)鑒定?檢測技術(shù)服務(wù)詳情介紹
Top-Downdànbáizhì組學(xué)(Top-Down Proteomics, TDP)是通過對完整dànbáizhì分子的直接分析,實現(xiàn)dànbáizhì全序列、結(jié)構(gòu)修飾和異構(gòu)體(proteoform)的全面解析。與Bottom-Up方法相比,Top-Down技術(shù)能夠更加準確地捕捉dànbáizhì的天然狀態(tài),尤其適用于研究翻譯后修飾(PTMs)、蛋白異構(gòu)體和蛋白藥物的結(jié)構(gòu)確認。本文將以研究者視角,深入剖析Top-Down LC-MS/MS從樣本準備到結(jié)果解讀的完整流程,揭示如何通過優(yōu)化關(guān)鍵步驟,實現(xiàn)高效、準確的dànbáizhì鑒定,并展示百泰派克生物科技在Top-Down領(lǐng)域的技術(shù)實力與平臺優(yōu)勢。
一、Top-Down LC-MS/MS技術(shù)原理與優(yōu)勢
Top-Down LC-MS/MS指的是將完整dànbáizhì在未經(jīng)酶切的前提下,通過液相色譜(LC)進行分離,再由串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)分析其分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息。與Bottom-Up相比,Top-Down具備如下顯著優(yōu)勢:
1、保留完整dànbáizhì結(jié)構(gòu)信息:包括翻譯后修飾(PTMs)、變異、剪接形式及二硫鍵等。
2、識別dànbáizhì異構(gòu)體(Proteoforms):細微結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致的功能異質(zhì)性能夠被jīngzhǔn解析。
3、簡化定量策略:避免因肽段冗余或酶切偏好導(dǎo)致的誤差。
4、提高特異性鑒定率:適合生物藥、毒液蛋白等需要精細結(jié)構(gòu)確認的樣本類型。
在質(zhì)譜硬件不斷升級和數(shù)據(jù)處理能力提升的背景下,Top-Down LC-MS/MS正逐漸走向?qū)嵱没瑸閺?fù)雜蛋白研究提供更優(yōu)解決方案。
二、Top-Down LC-MS/MSdànbáizhì鑒定全流程詳解
一個完整的Top-Down LC-MS/MS流程通常包括以下六個核心步驟,每一步均對zuì終鑒定效率與精度至關(guān)重要:
1、樣本前處理
Top-Down分析強調(diào)在盡量保留dànbáizhì天然結(jié)構(gòu)的前提下,去除所有可能影響質(zhì)譜分析的干擾物。這一過程包括:
(1)緩沖體系優(yōu)化:選用弱變性緩沖液(如20 mM ammonium acetate),避免SDS等強變性劑。
(2)脫鹽與去雜質(zhì):利用超濾、固相萃取或弱陽離子交換柱去除Na+、K+等無機鹽與低分子污染物。
(3)濃縮與定量:通常需≥100 ng/μL的蛋白濃度,確保質(zhì)譜靈敏度;使用BCA等方法jīngquè定量。
(4)低溫保存與新鮮檢測:避免蛋白變性、聚集或降解,建議-80°C保存并盡快使用。
百泰派克生物科技開發(fā)的Top-Down專用樣本處理套件,針對毒液、細胞裂解液等復(fù)雜樣本優(yōu)化了脫鹽效率與蛋白穩(wěn)定性,有效提升MS信號強度。
2、液相色譜分離
Top-Down LC采用反相色譜(RP-LC)為主,目標是高分辨率地分離天然態(tài)蛋白,常見策略包括:
(1)色譜柱選擇:C4、C5或C8反相柱,適合分離3–50 kDa范圍內(nèi)蛋白;粒徑≤3 μm,柱長10–15 cm。
(2)流動相系統(tǒng):使用0.1% FA/AA水溶液(A)和含0.1% FA/AA的ACN(B),提升分離與噴霧效率。
(3)溫控優(yōu)化:維持柱溫在40–60°C,增強峰形穩(wěn)定性,同時保護蛋白三級結(jié)構(gòu)。
百泰派克LC系統(tǒng)支持nanoLC與microLC兩種規(guī)格,覆蓋從單蛋白到復(fù)雜樣本的分離需求。
3、一級質(zhì)譜分析
MS1階段的目標是測定完整蛋白的jīngquè分子質(zhì)量,為proteoform的后續(xù)識別提供基礎(chǔ):
(1)儀器要求:采用高分辨率質(zhì)譜(如Orbitrap Eclipse,F(xiàn)T-ICR等),分辨率通常需≥60,000(m/z 400)。
(2)帶電峰去卷積:利用Xtract、Promass或MaxEnt等算法,將多電荷態(tài)峰還原為單一dànbáizhì量。
(3)質(zhì)量準確性:質(zhì)量誤差應(yīng)控制在<5 ppm,以支持proteoform篩選與修飾初篩。
百泰派克平臺實現(xiàn)對3–100 kDa蛋白的jīngzhǔn測定,支持低豐度蛋白的高靈敏檢測。
4、二級質(zhì)譜碎裂
通過MS/MS斷裂蛋白主鏈,獲取序列片段,實現(xiàn)修飾與異構(gòu)體定位。常用碎裂模式包括:
百泰派克在Top-Down流程中默認集成EThcD和HCD雙重模式,結(jié)合高能碎裂與PTM保護,提升結(jié)構(gòu)解析精度。
5、數(shù)據(jù)解析與dànbáizhì鑒定
Top-Down數(shù)據(jù)分析相較Bottom-Up更依賴zhuānyè算法支持,目前主流工具包括:
(1)TopFD+TopPIC:支持原位修飾識別,適合開放式搜索;
(2)ProSight PC/PD:商業(yè)軟件,適配多種斷裂模型,支持譜圖可視化;
(3)MSPathFinder、Byonic、MetaMorpheus:具備不同程度de novo能力;
(4)ProteoformAI(百泰派克):融合人工智能算法,支持未知修飾自動標注與結(jié)構(gòu)預(yù)測。
分析流程一般包括MS1質(zhì)量校準、MS2譜圖比對、修飾位點識別、蛋白異構(gòu)體比對與譜圖質(zhì)量評分。
6、結(jié)果可視化與報告輸出
Top-Down報告需具備:
(1)鑒定蛋白全序列圖譜,標注修飾與斷裂位點;
(2)所有proteoform列表及相對豐度分布;
(3)鑒定蛋白的質(zhì)量誤差、碎片覆蓋率統(tǒng)計;
(4)所用碎裂模式、譜圖比對得分等技術(shù)指標;
(5)可溯源的譜圖截圖與結(jié)構(gòu)注釋,支持發(fā)表/申報zhuānlì需求。
三、Top-Down LC-MS/MS高效dànbáizhì鑒定的核心影響因素
實現(xiàn)高效、jīngzhǔn的Top-Down分析,需從以下幾個方面協(xié)同優(yōu)化:
1、樣本質(zhì)量:越純凈的樣本,MS信噪比越高,檢出率越高。
2、蛋白分子量范圍:3–30 kDa是當(dāng)前Top-Down的“舒適區(qū)”;超出則需特殊策略(如多級分離、脫聚等)。
3、質(zhì)譜參數(shù)調(diào)控:碎裂電壓、離子注入時間、AGC設(shè)置等需根據(jù)蛋白類型細致調(diào)節(jié)。
4、數(shù)據(jù)算法支持:開放搜索、修飾識別、proteoform聚類能力直接決定解析深度。
5、數(shù)據(jù)庫質(zhì)量:需高質(zhì)量蛋白序列數(shù)據(jù)庫(如UniProt Swiss-Prot)、配套的修飾注釋數(shù)據(jù)。
作為國內(nèi)lǐngxiān的dànbáizhì組學(xué)服務(wù)平臺,百泰派克生物科技在Top-Downdànbáizhì鑒定領(lǐng)域構(gòu)建了完善的分析體系:配備Orbitrap Eclipse Tribrid,支持多碎裂模式和高通量采集;涵蓋樣本脫鹽、非變性處理、穩(wěn)定濃縮與定量;ProteoformAI平臺支持自動化proteoform識別與結(jié)構(gòu)注釋;已成功應(yīng)用于毒液蛋白、抗體藥物、合成生物產(chǎn)品結(jié)構(gòu)驗證等多個方向;涵蓋質(zhì)譜專家、生信工程師、項目管家,保障項目落地與科學(xué)輸出。
Top-Down LC-MS/MS技術(shù)通過保持dànbáizhì的完整結(jié)構(gòu),提供更jīngquè、更多維的dànbáizhì信息,已成為蛋白修飾研究、dànbáizhì鑒定、天然藥物挖掘、蛋白藥結(jié)構(gòu)確認等gāoduān研究領(lǐng)域的核心工具。隨著質(zhì)譜硬件不斷升級、碎片效率提升與AI算法應(yīng)用深入,Top-Down將實現(xiàn)從科研探索向標準應(yīng)用的全面突破。百泰派克生物科技致力于推動Top-Down蛋白組學(xué)的普及與產(chǎn)業(yè)化,為科研人員提供從樣本處理到結(jié)構(gòu)注釋的一站式解決方案。如您正在從事與蛋白結(jié)構(gòu)、修飾相關(guān)的研究項目,歡迎聯(lián)系百泰派克獲取專屬技術(shù)方案與測試服務(wù)。
百泰派克生物科技特色項目
一、蛋白測序
百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統(tǒng)對dànbáizhì序列進行分析,提供基于質(zhì)譜的蛋白測序分析服務(wù),包括對dànbáizhì的氨基酸組成分析,Nduāncèxù,Cduāncèxù和全序列分析,以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務(wù)。對于未知理論序列的dànbáizhì,提供基于從頭測序法的dànbáizhì從頭測序服務(wù),對蛋白序列進行分析。
※服務(wù)優(yōu)勢:
1.采用目前世界上先進的質(zhì)譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;
2.可實現(xiàn)對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;
3.可測定蛋白N端多達 70個氨基酸序列;
4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;
5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug,即可完成檢測;
6.測序不受N端封閉,PEC和和糖基化等N端修飾的影響。
二、dànbáizhì組學(xué)
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜平臺結(jié)合Nano-LC,提供定量dànbáizhì組學(xué)、靶向dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、翻譯后修飾蛋白組學(xué)等多種dànbáizhì組學(xué)分析服務(wù)。此外,百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學(xué)服務(wù),助力微量樣本蛋白組學(xué)、大樣本群醫(yī)學(xué)及高通量修飾組學(xué)等研究工作。
※服務(wù)優(yōu)勢:
1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規(guī)模實驗分析,發(fā)現(xiàn)新的生物標記物;
2.體內(nèi)體外多種dànbáizhì標記方法,適用于分析組織、細胞、血液等多種樣品;
3.質(zhì)譜分析靈敏度高,實驗結(jié)果重復(fù)度高;
4.可檢測較低豐度蛋白,線性范圍廣;
5.zhuānyè生物信息學(xué)分析,分析更系統(tǒng)準確。
三、單細胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析
百泰派克生物科技采用Fluidigm質(zhì)譜流式系統(tǒng)進行單細胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析,采用金屬元素標記物(通常是金屬元素標記的特異抗體)標記細胞表面和內(nèi)部的分子,然后用流式細胞原理分離單個細胞,再用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)分析單個細胞的原子質(zhì)量譜,zuì后將原子質(zhì)量譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細胞表面和內(nèi)部的信號分子表達量。
※服務(wù)優(yōu)勢:
1.技術(shù)先進,填補技術(shù)空白
采用金屬標記抗體技術(shù),避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問題。可在單細胞層面上對多種指標同時進行表征,百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標蛋白。
2.分析數(shù)量大,成本較低
單細胞RNAseq受成本等因素限制,所有樣本細胞匯總的分析數(shù)目一般在2x10^4個左右,而流式質(zhì)譜技術(shù)一次(單樣本)就可分析至少10^5的細胞,實現(xiàn)了數(shù)量級的提高,且成本不高于單細胞RNAseq。
3.應(yīng)用前景大
①流式質(zhì)譜結(jié)果可以給出細胞亞群的變化,在臨床診斷、疾病機制研究等方面具有極大的研究前景;
②將金屬標簽技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合會有新應(yīng)用方向。除常規(guī)蛋白外,質(zhì)譜流式細胞技術(shù)還可用于蛋白翻譯后修飾;
③可檢測細胞存活率、細胞大小、mRNA轉(zhuǎn)錄子表達量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。
四、基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)
百泰派克生物科技的基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實現(xiàn)10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學(xué)分析平臺進行免疫肽組學(xué)分析,可從zuì小的樣品材料中進行可重復(fù)的識別和定量。該服務(wù)可以應(yīng)用于大規(guī)模的研究,旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案,深入挖掘未知的靶標。
五、生物藥物表征
百泰派克基于高分辨率質(zhì)譜技術(shù),MALDI TOF,高效色譜分離技術(shù),提供一系列完善的生物藥物分析方案,從dànbáizhì、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結(jié)構(gòu)分析,到產(chǎn)品變異性和純度分析。旨在提供優(yōu)質(zhì)生物藥物分析服務(wù),幫助生物醫(yī)藥生產(chǎn)商提高生物藥物品質(zhì)。
百泰派克生物科技七大檢測平臺
百泰派克生物科技-生物制品表征,生物質(zhì)譜多組學(xué)優(yōu)質(zhì)服務(wù)商
北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質(zhì)量控制檢測和項目驗證等zhuānyè服務(wù)。公司實驗室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規(guī)和指導(dǎo)原則,通過CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量體系認證,建立了完備的質(zhì)量體系,數(shù)據(jù)冷熱/異地備份,設(shè)備定期計量/期間核查,軟件審計追蹤,為客戶提供一體化解決方案和技術(shù)服務(wù),支持新藥研發(fā)、藥物申報注冊和生產(chǎn)放行。
1.公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系,zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的CRO檢測分析服務(wù);
2.獲國家CNAS實驗室認可,為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務(wù);
3.業(yè)務(wù)范圍覆蓋dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、代謝組學(xué)、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學(xué)生物質(zhì)譜整合分析等;
4.七大質(zhì)量控制檢測平臺,滿足您一站式服務(wù)需求;
5.服務(wù)3000+企業(yè),10000+客戶的選擇;
6.致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務(wù)!