一、技術原理與生物學基礎

1. 電穿孔的物理機制

• 膜電位改變：短時高壓電場（通常500–4000 V/cm）使細胞膜磷脂雙層發生極化，形成親水性臨時孔隙（直徑≈10 nm），持續時間毫秒級。

• 分子遞送機制：帶負電的DNA/RNA在電場驅動下以電泳方式穿過孔隙進入胞質，后續依賴細胞自身機制擴散至核內（核膜無有效電場作用，故“核電轉”為偽概念）。

• 可逆性與安全性：

• 可逆電穿孔：低強度脈沖后膜修復完整，細胞存活率>90%。

• 不可逆電穿孔：高強度脈沖致膜結構yong久破壞，用于腫瘤消融（非基因操作）。

2. 關鍵參數優化

注：物種差異性顯著，如小鼠受精卵需30V脈沖（3ms時長+97ms間隔，7循環）。

二、標準化操作流程

1. 體外電轉（以受精卵為例）

1. 樣本制備：

• 收集受精卵（體內/體外受精），用低鹽緩沖液（如Opti-MEM）清洗3次，去除血清干擾。

2. 電轉體系構建：

• 將受精卵與目標分子（如CRISPR/Cas9核糖核蛋白）混合，置于電轉杯或定制電極槽（如LF501PT1-10鉑金電極）。

3. 脈沖施加：

• 優化參數（如小鼠：30V，3ms脈沖×7循環），脈沖間隔97ms避免過熱。

4. 復蘇培養：

• 電轉后立即用M2培養基清洗，轉入KSOM培養液恢復，37℃/5% CO?孵育至囊胚期。

2. 體內電轉革新：i-GONAD技術

• 原理：跳過體外操作，直接對孕鼠輸卵管壺腹部施加電場，轉染體內受精卵。

• 流程：

1. 孕鼠麻醉后暴露輸卵管。

2. 注入外源DNA溶液至壺腹部。

3. 定制電極夾住輸卵管施放電脈沖（參數同體外）。

• 優勢：

• 避免體外培養損傷，胚胎存活率提升20%。

• 已成功應用于小鼠、大鼠，潛力擴展至豬、猴。