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CRISPR/Cas12b系統實驗

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CRISPR/Cas12b系統

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一、分子機制與結構特性

(一)系統定義與分類

CRISPR/Cas12b(原稱 C2c1)屬于 Class 2 Type V-B 型 CRISPR 系統,是繼 Cas9 和 Cas12a 后的重要基因編輯工具。其核心特征包括:

  1. 雙 RNA 引導機制

    • 需 crRNA 與 tracrRNA(可融合為 sgRNA)共同引導靶向切割,兼具 Cas9 與 Cas12a 的部分特性 。

  2. 切割模式

    • 單一 RuvC 結構域 切割雙鏈 DNA,形成 5-6 nt 的黏性末端(5' 突出),利于同源重組修復(HDR)。

  3. PAM 識別

    • 依賴 T-rich PAM 序列(如 5'-TTN-3'),擴展了 AT 富集基因組的編輯能力 。

(二)結構優勢

特性Cas12b對比 Cas9/Cas12a
蛋白大小約 1,100 氨基酸(最?。?/td>比 Cas9(1,600 aa)和 Cas12a(1,300 aa)更小 
RNA 需求需 crRNA + tracrRNA(可融合為 sgRNA)比 Cas12a(僅需 crRNA)復雜,但比 Cas9 簡化 
熱穩定性溫度敏感型(40–55℃激活)需工程化改造以適配哺乳動物細胞 

二、技術優勢與性能

(一)核心優勢

  1. 低脫靶率

    • GUIDE-seq 檢測顯示脫靶率 顯著低于 Cas9(錯誤插入/缺失減少 >50%)。

  2. 高特異性

    • crRNA 引導序列更長(>42 nt),靶向精度更高 。

  3. 編輯模式

    • 誘導 純插入突變率低,更傾向于產生小片段缺失,減少功能不可預測性 。

  4. 病毒載體適配性

    • 小分子量更易包裝進 AAV 或慢病毒載體,提升體內遞送效率 。

(二)與同類系統對比

參數Cas12bCas9Cas12a
PAM 序列5'-TTN-3'(T 富集)5'-NGG-3'(G 富集)5'-TTTV-3'(T 富集)
切割末端黏性末端(5' 突出)平末端黏性末端(5' 突出)
反式切割活性? 無? 無? 有(可切割 ssDNA)
多基因編輯需多 sgRNA需多 sgRNA? 支持 crRNA 陣列

:Cas12b 切割模式使其在 基因治療 中避免產生新表位,降低免疫風險 。


三、應用場景與前沿案例

(一)生物醫學應用

  1. 抗病毒治療

    • HIV :在 T 細胞中單次編輯即可清除全部傳染性 HIV,效率優于 Cas9 。

  2. 遺傳病修復

    • 聯合 HDR 通路實現 β-地中海貧血基因精準修復,血紅蛋白恢復至正常水平 。

  3. 腫瘤免疫

    • 編輯 PD-1/CTLA-4 雙靶點,降低 CAR-T 細胞耗竭 。




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