蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶檢測試劑盒

[試劑盒簡介]

蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶（Protein Serine/Threonine Kinase, STK）是一種能使蛋白質中的絲氨酸或蘇氨酸殘基上的羥基磷酸化的酶，涉及控制細胞增殖，分化和致癌作用的信號轉導途徑，具有非常重要生理功能。加拿大ImmuneChem自主研發(fā)的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶檢測試劑盒（STK檢測試劑盒）采用非放射性檢測技術，為篩選STK的抑制劑或激活劑以及對純化或部分純化的STK的酶活性定量檢測提供了一種安全，快速和可靠的方法。

     本檢測試劑盒基于固相酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）的原理，利用STK的特異性多肽底物和能特異性識別磷酸化底物的多克隆抗體，檢測液相中的STK活性。具體方法如下：在微孔板上預先包被STK的特異性多肽底物，將含有STK激酶的待測樣品加入相應的孔中，并加入ATP開始底物磷酸化反應。反應結束后，向孔中加入特異性抗體以結合特定磷酸化的底物，隨后特異性抗體被過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗結合。而偶聯(lián)的HRP可作用于四甲基聯(lián)苯胺底物（TMB）顯色，顯色過程被酸性終止液終止后，在450nm處用酶標儀測定顏色強度，其顏色強度的與STK的酶活性成正比關系 （圖1）。

圖1  STK檢測試劑盒分析原理

[應用范圍]

1.  含有單一STK的純化或部分純化的激酶樣品的活性測定

2.  篩選STK的抑制劑或激活劑

        表1是經過檢測驗證可用本STK檢測試劑盒的激酶列表，但由于研究有限，未列入表中的其它STK也可能用本試劑盒檢測。

[方法概要]

1.  室溫平衡：底物微孔板，抗體稀釋緩沖液，酶反應稀釋緩沖液，TMB底物和終止液

2.  將60 μL待測樣品加入底物微孔板相應的孔中

3.  在每個孔中加入10 μL ATP溶液，開始底物磷酸化反應

4.  37°C孵育30-60分鐘

5.  倒去每個孔中的液體，終止反應

6.  用300 μL 1X洗滌緩沖液洗孔4次

7.  在每個孔中加60 μL特異性磷酸化底物抗體溶液

8.  室溫孵育60分鐘

9.  用300 μL 1X洗滌緩沖液洗孔4次

10.  在每個孔中加入60 μL抗兔IgG: HRP工作液

11.  室溫孵育30分鐘

12.  用300μL 1X洗滌緩沖液洗孔4次

13.  在每個孔中加入60 μL TMB底物

14.  室溫顯色15-30分鐘，顯色時間根據顏色強度變化確定

15.  在每個孔中加入60 μL終止液

16.  測量450nm處的吸光度

[警告]

    本檢測試劑盒僅供實驗室研究使用，不用于醫(yī)學診斷

•  抗兔IgG: HRP（組分# 103）的活性受親核試劑如疊氮化物和羥胺的影響

•  在開始進行樣品分析之前，請完整的閱讀試劑盒說明書

[試劑盒組分]

 本STK檢測試劑盒包含以下組分，足夠供96孔樣品檢測使用：

[產品儲存]

•  在4°C條件下，試劑盒中所有試劑組分均可穩(wěn)定儲存至有效期

•  未用完的底物微孔板板條，應重新封裝于鋁箔袋中（加干燥劑），在4°C可繼續(xù)儲存至有效期

•  剩余的ATP溶液可在-20°C儲存6個月或至試劑盒有效期，以較早者為準

[需自備的材料]

• 活性STK：STK必須存儲于-70°C。如果需在不同時間多次測定樣品，可在解凍后將活性酶樣品分裝成小管儲存于-70°C，此后檢測樣品前只解凍一次。應避免反復凍融樣品，每次凍融都可能導致激酶活性降低

•  去離子水或蒸餾水

•  移液器：能夠精確量取1 μL至1000 μL的液體

•  一次性移液器吸頭

•  自動洗板機或洗瓶

•  燒杯

•  刻度量筒

•  吸水紙

•  酶標儀：能夠測量450 nm處的吸光值

•  黏貼密封紙

[使用建議]

    由于每種STK對底物的反應活性不盡相同（表1），因此在進行酶活性測定之前，建議進行預實驗以確定合適的樣品稀釋度和反應時間，以便后續(xù)研究。

•  建立不同酶濃度（包括空白對照）與反應時間的曲線，以確認酶對底物磷酸化的線性反應

• 根據預實驗結果選擇反應時間和酶濃度，對于抑制劑/激活劑篩選，建議使用給出80% 最大信號值時的酶濃度

[試劑準備]

注意：所有試劑應在使用前新鮮配制

注意：除非另有說明，否則試劑的配制量基于使用完整12×8孔的試驗。如果僅使用96孔微孔板的一部分，請按照前述方法儲存剩余部分板條（見“產品儲存”）

1.  試劑溫度

            使用前將以下試劑平衡至室溫：

•  微孔板（組分# 101）

•  抗體稀釋緩沖液（組分# 104）

•  激酶反應稀釋緩沖液（組分# 105）

•  20X洗滌緩沖液（組分# 107）

•  TMB底物（組分# 108）

•  終止液（組分# 109）

2.  活性STK的準備

    注意： STK活性對溫度變化敏感，需在冰上解凍和稀釋酶樣品

a.  活性STK用作陽性對照，用激酶反應稀釋緩沖液稀釋至最終體積60 μL，置冰上備用

b.  用60 μL激酶反應稀釋緩沖液（不含激酶）作為空白對照

3. ATP（組分# 106）

a.  打開蓋子之前離心管子，以避免產品損失

b.  用2 mL 激酶反應稀釋緩沖液溶解ATP粉末

c.  輕輕顛倒混勻

d.  ATP溶液準備完畢，可用于“測試步驟”（見第8頁）

e.  未用完的ATP溶液可在-20℃儲存6個月或至試劑盒有效期，以較早者為準

4.  抗兔IgG: HRP（組分# 103）

a.  打開蓋子之前離心管子，以避免產品損失

b. 用抗體稀釋緩沖液稀釋抗兔IgG: HRP至1 μg/ mL（1: 1000），96孔（60μL/孔）需要至少6 mL的工作液，如果僅使用部分微孔板，則僅配制所需的量

c.  輕輕顛倒混勻

d.  抗兔IgG: HRP工作液準備完畢，可用于“測試步驟”（見第8頁）

e.  不要重復使用或儲存任何剩余的抗兔IgG: HRP工作溶液

5.  洗滌緩沖液

a.  將20X洗滌緩沖液平衡至室溫，并輕輕搖勻以溶解儲存期間可能形成的晶體沉淀

b. 將30 mL 20X洗滌緩沖液與570 mL去離子水或蒸餾水混合，即為1X洗滌緩沖液，在室溫下可穩(wěn)定放置4周，若需長期儲存，則應放置在4°C

[樣品準備]

1.  STK樣品溶液

注意：本STK檢測試劑盒僅適用于含有單一STK的純化或部分純化的酶樣品測試，對于含有一種以上STK的樣品，由于其含有的不同激酶都可能使底物磷酸化，因此不推薦使用本試劑盒。

 部分純化的酶樣品制備

a.  選擇合適的色譜柱和緩沖液用于STK純化

b.  樣品上柱，并運行所需的純化方案

c.  如有必要，用激酶反應稀釋緩沖液稀釋過柱后分部收集的樣品

 注意：建議將分部收集的樣品進行梯度稀釋（如將樣品按1: 2或1: 3梯度稀釋，或將10，15，20，30和60 μL樣品稀釋到60 μL）。

注意：STK純化沒有普遍適用的方法，不同的STK需參考不同的文獻。

2.  抑制劑或激活劑篩選

a.  將抑制劑或激活劑稀釋到合適的濃度，建議同時使用空白稀釋液本身作為陰性對照

b.  在開始酶反應之前，將抑制劑和STK孵育一段時間

注意：反應時間和酶濃度由實驗人員通過預實驗確定，如第5頁的“使用建議”部分所述。酶濃度建議使用給出80% 最大信號值時的濃度。

[測試步驟]

1.  底物微孔板準備

    確定測試需要的底物微孔板孔數，如果需要量少于96個，則從框架中取出多余的板條，并將它們放回到鋁箔袋中，加干燥劑后重新封裝，儲存于4°C。

2.  加樣和磷酸化反應

a.  在相應的孔中加入60 μL各樣品：

     •  純化的活性STK（樣品準備方法見第6-7頁）

•  待測樣品（樣品準備方法見第6-7頁）

•  空白對照（不含激酶的激酶反應稀釋緩沖液）

•  陰性對照（空白抑制劑/活化劑緩沖液，用于抑制劑/活化劑篩選研究）

b. 向每個孔中加入10 μL ATP溶液（溶液配制方法見第6頁），開始底物磷酸化反應。為避免交叉污染，需更換每個孔的移液器吸頭

c.  用黏貼密封紙或塑料蓋覆蓋微孔板，37℃ 孵育30-60分鐘（如能同時輕輕搖動微孔板效果更佳）

注意：反應時間根據預實驗確定（見第5頁“使用建議”

d.  倒去所有孔中液體，終止磷酸化反應，將孔口朝下輕拍吸水紙以去除殘余液體

3.  洗滌

a.  倒去所有孔中液體

b. 使用多通道移液器、自動洗板機或洗瓶，向孔中加300 μL 1X洗滌緩沖液（為了減少背景，可在每次洗滌之間用1X洗滌緩沖液浸泡30-60秒）

c.  倒去所有孔中液體，按同樣的方法用1X洗滌緩沖液重復洗滌3次，共洗滌4次

d.  第4次洗滌后，倒去所有孔中液體，將孔口朝下輕拍吸水紙以去除殘余液體

4.  加特異性磷酸化底物抗體

a.  在每個孔加入60 μL特異性磷酸化底物抗體

b. 用新的黏貼密封紙（或塑料蓋）覆蓋微孔板條，室溫孵育60分鐘（如能同時輕輕搖動微孔板效果更佳）

c.  按步驟3所述方法洗滌微孔板

5.  加抗兔IgG: HRP工作液（新鮮配制，見第6頁）

a.  在每個孔中加入60 μL新鮮配制的抗兔IgG: HRP工作液。

b. 用新的黏貼密封紙（或塑料蓋）覆蓋微孔板條，室溫孵育30分鐘（如能同時輕輕搖動微孔板效果更佳）

c.  按步驟3所述方法洗滌微孔板

6.  加TMB底物和酸性終止液

a.  在每個孔中加入60 μL TMB底物

b. 室溫孵育15-30分鐘（孵育時間由實驗人員根據顏色強度變化決定）

c.  按TMB底物的加樣順序，向每個孔中加入60 μL終止液

7.  吸光度測定

a.  按產品說明書設置酶標儀

b.  設定波長為450 nm

c.  測量吸光度

[STK活性測定示例]

         圖2顯示了使用本檢測試劑盒測試活性STK純品的實驗結果，該分析試驗按“測試步驟”所述進行，酶反應條件為：37℃，30分鐘。該試驗數據僅為示例，不應用于計算實際的檢測結果。

圖 2  STK活性測定結果示例

[注意事項]

•  對本分析方法的修改可能會影響該STK檢測試劑盒的性能

• 試劑盒中各組分僅在該批號試劑盒產品中保證質量，請不要將其與其他批號試劑盒中的組分混合使用

[參考文獻]

1. Robinson-White, A. and Stratakis, C.A. (2002) Ann. N. Y. Acad. Sci. 986: 256-270.
2. Dell’Acqua, M.L. and Scott, J.D. (1997) J. Biol. Chem. 272: 12881-12884.
3. Amieux, P.S., Cummings, D.E., Motamed, K., Brandon, E.P., Wailes, L.A., Le, K., Idzerda, R.L. and McKnight, G.S. (1997) J. Biol. Chem. 272: 3993-3998.
4. Matyakhina, L., Lenherr, S.M. and Stratakis, C.A. (2002) Ann. N. Y. Acad. Sci. 986: 148-157.
5. Lange-Carter, C.A., Fossli, T., Jahnsen, T. and Malkinson, A.M. (1990) J. Biol. Chem. 265: 7814-7818.
6. Cicirelli, M.F., Pelech, S.L. and Krebs, E.G. (1988) J. Biol. Chem. 263: 2009-2019. 

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