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2010
03-24

Northern blot技術
Northernblot技術經乙二醛和二甲基亞砜變性處理后進行的RNA電泳這一方法原于McMaster和Carmichael（1977）。含有乙二醛－DMSO的凝膠比含有甲醛的凝膠更難于進行電泳，因為前者泳動速率較慢而且需將電泳液時行循環(huán)以避免電泳過程中形成過高的H＋梯度。盡管上述兩種凝膠具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝膠對RNA進行分級離，通常Northern雜交所顯示的RNA條帶更為銳利。1）在滅菌的微理離心管內，混勻下列液體：6mol/L乙二醛5
2010
03-24

植物組織RNA提取
植物組織RNA提取的難點及對策從植物組織中提取RNA是進行植物分子生物學方面研究的必要前提。要進行Northern雜交分析，純化mRNA以用于體外翻譯或建立cDNA文庫，RT-PCR及差示分析等分子生物學研究，都需要高質量的RNA。因此，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順利進行上述研究的關鍵所在。a）*Y（WL從文獻報道上看，有許多植物就是由于未能有效地分離純化其組織中的RNA，而阻礙了其分子生物學方面研究的進展。一般認為在這些植物組織中，或富含酚類化合物，或富含多糖，或含有某些尚無法
2010
03-15

復蘇方法
復蘇方法1．從液氮罐中取出安剖；有時因安剖未封嚴，浸入了液氮，取出后因安剖內液氮迅速氣化而發(fā)生爆炸，因此應帶有防護眼睛和手套。2．迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上蓋并不時搖動，盡快解凍。3．剪開紗布口袋，取出安剖，用70％酒精擦拭消毒后，凈化臺上打開蓋，用吸管吸出細胞懸液，裝入離心管中，再補加10ml培養(yǎng)液，吹打使細胞懸浮。4．低速離心（500～1000轉/分）5分鐘，取上清后再重復用培養(yǎng)液漂洗、離心。5．加入培養(yǎng)液適當稀釋后，再移裝入培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)
2010
03-15

蛋白質提取的方法
蛋白質提取的方法總匯1、植物組織蛋白質提取方法1、根據(jù)樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液，可根據(jù)材料不同適當加入），準備提取液放在冰上。2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時）。3、用離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃4、提取上清夜，樣品制備完成。蛋白質提取液：300ml1、1Mtris-HCl（PH8）45ml2、甘油（Glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g這種
2010
03-15

幾種常用轉化細胞的轉化
幾種常用轉化細胞和轉化技術1）致癌化學物轉化細胞：轉化敘利亞地鼠胚胎細胞實驗1．取材：妊娠后第13天取材，取數(shù)個同窩胚胎，去頭和內臟，在無菌條件下剪碎至米粒大小，再用0.25％胰蛋白酶（含0.01％EDTA）37℃消化30分鐘，濾過、低速離心、吸除消化液、加入營養(yǎng)液、制備成細胞懸液、接種入75cm/培養(yǎng)瓶中，接種密度10～20×106/75cm，37℃培養(yǎng)2～3天，在順利情況下能迅速長滿瓶面。2．貯存：選大批生長狀態(tài)良好的細胞凍存，儲以備用。3．致癌物處理：取凍存細胞，解凍，接種于25ml培養(yǎng)瓶
2010
03-10

如何提高RT-PCR反應體系的靈敏度
如何提高RT-PCR反應體系的靈敏度：1、分離高質量RNA成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑如EDTA或SDS等，以及盡可能減少基因組DNA污染。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的大值。2、使用無RNaseH活性的逆轉錄酶在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引
2010
03-08

影響質粒提取的因素
影響質粒提取的因素：質粒提取的得率和質量與很多因素有關，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細胞的裂解、質粒拷貝數(shù)、質粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附柱的吸附量等。宿主菌種類質粒主要存在于細菌、放線菌和真菌細胞中，多數(shù)情況下我們是從大腸桿菌中提取質粒。大腸桿菌的菌株不同會影響質粒提取的質量。從宿主菌如DH5α和*0中可以得到高質量的質粒DNA。HBl01和它的衍生菌株，如TG1和JM系列會在裂解時產生大量的糖類，如果沒有*去除，將抑制后續(xù)實驗中的酶活性，影響質粒DNA提取的質量。另外，有些菌株有非常高的內切酶活性
2010
03-08

質粒提取原理及流程
質粒提取原理及流程：較常用的質粒DNA提取方法有3種：堿裂解法、煮沸法和去污劑（如Triton和SDS）裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質粒（15kb）。堿裂解法是一種應用為廣泛的制備質粒DNA的方法，其原理為：染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質粒DNA在回到中性時即恢復其天然構象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分
2010
03-08

質粒DNA分離和純化
質粒DNA分離和純化：純化要求質粒DNA中不應存在對后續(xù)實驗中的酶活性有抑制作用的有機溶劑分子或過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖、脂類、基因組和RNA的污染。不同的后續(xù)實驗對于質粒純度的要求不同，常規(guī)的分子生物學實驗（如酶切、測序等）普通純度的質粒即可滿足實驗，而對于轉染實驗，要求質粒的純度較高（如高純度或無內毒素）。可以選擇不同的質粒提取試劑盒以滿足不同的實驗要求。純化方法用硅基質材料吸附質粒DNA來代替乙醇沉淀的純化方式，提取的質粒純度高、操作方便快捷，可選擇的試劑盒有兩
2010
02-27

Lowry法蛋白濃度測定
Lowry法蛋白濃度測定目錄號規(guī)格價格PC0030-10001000T280.00產品簡介：Lowry法包括兩步反應：*步是在堿性條件下，蛋白質與銅作用生成蛋白質-銅絡合物；第二步是此絡合物將Folin試劑還原，產生深藍色，顏色深淺與蛋白質含量成正比。定量范圍為5～100μg/ml蛋白質。Folin試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白質因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同。Lowry法測定較為不受脂類物質干擾，適
2010
02-27

BCA蛋白濃度測定
BCA蛋白濃度測定目錄號規(guī)格價格PC0020-500500T280.00產品簡介：Bicinchoninicacid（BCA）法是在世界上常用的蛋白濃度檢驗方法之一BCA法基礎上改進而成。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質與Cu2+絡合并將Cu2+還原成Cu+。兩分子BCA與一個Cu+螯合形成穩(wěn)定的紫藍色復合物，在562nm處有高的光吸收值并與蛋白質濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質濃度。與Lowery法相比，BCA蛋白測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復合物穩(wěn)定性俱
2010
02-27

Bradford蛋白濃度測定
Bradford蛋白濃度測定目錄號規(guī)格價格PC0010-25002500T150.00產品簡介：Bradford法是常用的蛋白質快速定量方法。CoomassiebrilliantblueG-250與蛋白質結合使染料的大吸收峰由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色由棕色變?yōu)樘m色，595nm波長下吸光度值與蛋白含量成正比。靈敏度比Lowry法高4倍，與BCA法相當。反應迅速，2分鐘即可達到平衡并在1小時內保持穩(wěn)定。操作簡便，只需要一種反應試劑。干擾物質少，鈉鉀鎂離子、Tris、葡萄糖和蔗糖、甘油、巰
2010
02-27

蛋白電泳（PAGE）
蛋白電泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在加速劑N，N，N，N—四甲基乙二胺（簡稱TEMED）和催化劑過硫酸銨（簡稱AP）或核黃素（即vitaminB2）的作用下聚合交聯(lián)成三維網狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE）SDS－PAGE是在要電泳的樣品中加入含有SDS和β-巰基乙醇（或者DTT）的樣品處理液，SDS可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的
2010
02-04

基因組DNA提取的原則
基因組DNA提取的原則1、保證核酸一級結構的完整性（因為遺傳信息全部儲存在核酸一級結構中，故完整的一級結構是保證核酸結構與功能研究的基礎）。2、排除其它分子（如蛋白質、多糖、脂類、有機溶劑等）的污染，使下游試驗順利進行。
2010
02-02

胍鹽/β-巰基乙醇法
胍鹽/β-巰基乙醇法適用于各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料。在這種方法中，胍鹽使細胞充分裂解，β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實驗全程中可以抑制RNase的活性，保護RNA不被降解。
2010
02-02

異硫氰酸胍/苯酚法
異硫氰酸胍/苯酚法異硫氰酸胍/苯酚法是一種傳統(tǒng)的RNA提取方法，適用于大部分動植物材料，但對于次生代謝產物較多的植物材料提取RNA效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復合體解離，并將RNA釋放到溶液中，采用酸性酚/氯仿混合液抽提，低pH值的酚將使RNA進入水相，而蛋白質和DNA仍留在有機相，從而可以完成RNA的提取工作。Solarbio公司的Trizol和總RNA提取試劑盒就是基于異硫氰酸胍/苯酚法開發(fā)的一種總RNA提取試劑和試劑盒。Trizol法應用非常廣泛，適用于包括動物組織、微生物材料、培養(yǎng)細胞
2010
02-02

DNA的儲存
DNA的儲存儲存溶液：DNA為兩性解離分子，在堿性條件下較穩(wěn)定，因此一般用TE（pH8.0）保存。TE的成分為：10mMTris-HCl（Tris與鹽酸形成強的緩沖對）；1mMEDTA（乙二胺四乙酸，能螯合二價金屬陽離子，抑制DNase的活性）；pH8.0（堿性條件可減少DNA的脫氨作用，防止降解）。ddH2O的正常pH值為7.0，可作為DNA的儲存液，但有些實驗室制備的ddH2O呈酸性（pH值小于7.0），這不僅影響DNA的洗脫效率，而且導致長時間保存的DNA容易發(fā)生降解。因此建議用TE作為D
2010
01-26

RNA純化及獲得
RNA純化及獲得純化要求RNA樣品中不應存在對酶（如逆轉錄酶）有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染。排除DNA分子的污染。純化方法及沉淀1、有機溶劑抽提法氯仿抽提：在使用RNA提取試劑進行RNA提取時，常使用氯仿進行抽提，以去除蔗糖、蛋白等雜質，并促進水相與有機相的分離，從而達到純化RNA的目的。沉淀：氯仿抽提RNA后，一般采用異丙醇或乙醇來沉淀水相RNA。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇，室溫沉淀20-30分鐘，高速離心，
2010
01-26

RNA評價與鑒定
RNA評價與鑒定提取得到RNA溶液后，我們需要對RNA進行相關的質量檢測，以確定它是否符合后續(xù)實驗的要求。RNA用于不同的后續(xù)實驗，對其質量要求不盡相同。cDNA文庫構建要求RNA完整且無酶等抑制物殘留；Northernblot實驗對RNA完整性要求較高，對酶反應抑制物殘留要求較低；RT-PCR實驗對RNA完整性要求不太高，但對酶反應抑制物殘留要求嚴格。因此在進行不同的實驗時應選擇不同的方法純化RNA，以達到佳的實驗效果。RNA得率檢測——分光光度計法RNA得率有很強的組織特異性，不同組織RNA
2010
01-26

RNA的保護
RNA的保護與DNA提取實驗相比，RNA的提取實驗常常較為困難，這主要是由于RNA非常容易降解。而造成RNA降解的原因來自內因和外因兩個方面。內因：RNA核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，易被水解；外因：生物體內和外部環(huán)境中存在大量RNase，并且RNase不易失活，高溫后仍然能夠正確折疊恢復活性。因此，從樣品的儲存、RNA的提取以及RNA提取完成后的保存，我們都需要格外小心，處處防范RNase對RNA的降解作用。下面，我們將介紹RNA提取過程中保護RNA的措施。1、提取前的RNA保護材料樣品中

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