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高致病性豬藍耳病病毒熒光PCR檢測試劑盒(實時熒光PCR法) 使用說明書

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    2025年06月06日
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高致病性豬藍耳病病毒熒光PCR檢測試劑盒,(實時熒光PCR法),PCR試劑盒
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上海雅吉生物科技有限公司
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資料簡介

高致病性豬藍耳病病毒熒光PCR檢測試劑盒(實時熒光PCR法)

使用說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名高致病性豬藍耳病病毒熒光PCR檢測試劑盒(實時熒光PCR法)

英文名稱: Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

豬藍耳病又名豬繁殖與呼吸綜合征,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV引起的豬的一種傳染病, 不同年齡、 品種和性別的豬均能感染,以流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬呼吸困難、 敗血癥、高死亡率等為主要特征。2006年迄今,我國多個省份暴發(fā)的豬藍耳病被證實為豬藍耳病病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,HP-PRRSV),與豬藍耳病病毒普通株相比,病毒株具有更高毒力和致病性,能引起更高的死亡率。

本試劑盒利用實時熒光PCR原理,定性檢測高致病性豬藍耳病病毒,對致病性豬藍耳病病毒診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。

【原    理】

本試劑盒針對高致病性豬藍耳病病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含高致病性豬藍耳病病毒基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

試劑盒組成

序號

組成

50T/盒

1

HP-PRRSV RT-PCR反應(yīng)液

875 μL×1管

2

HP-PRRSV混合

125 μL×1管

3

HP-PRRSV陽性對照

40 μL×1管

4

HP-PRRSV陰性對照

40 μL×1管

5

說明書

1份

注:陰性對照為滅菌純水,陽性對照為含高致病性豬藍耳病靶基因的質(zhì)粒

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個月。

【適用儀器】ABI7500、羅氏 96/480、安捷倫、伯樂、國產(chǎn)博日、宏石等各種熒光定量 PCR 儀

【樣本要求】

1.血液或血清樣品:使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。

2.肺臟、淋巴結(jié)和脾臟樣品:取樣本20 g,加少量滅菌PBS,用無菌研磨器研磨至糊狀,再用4倍體積的PBS稀釋成乳劑,8000 rpm 4℃離心10 min,取上清待檢。

3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

4.樣本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于2~8℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80以下,避免反復(fù)凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

2)核算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)(1T)+陽性對照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)

單反液配制表

RT-PCR反應(yīng)液

17.5 μL

混合

 2.5 μL

3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))

QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣(樣本處理區(qū))

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本RNA各5 μL、終體積25 μL/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μL/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCR(PCR擴增區(qū))

1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

2)按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增

反應(yīng)體積

25μL

通道選擇

FAM通道采集高致病性豬藍耳病病毒信號

PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

反轉(zhuǎn)錄

 50℃:10分鐘(min)

1

預(yù)變性

95℃:3分鐘(min)

1

PCR擴增

95℃:5秒(s)

40

55℃:40秒(s)

(此階段結(jié)束時采集熒光信號)

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團選擇None。

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct值≤35

2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定:

1)陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

2)可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進行重復(fù)檢測,如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

3)陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果

標(biāo)本檢測結(jié)果解釋

FAM

陰性(-)

標(biāo)本中未檢出高致病性豬藍耳病病毒RNA

陽性(+)

標(biāo)本中檢測出高致病性豬藍耳病病毒RNA

【注意事項】

1. 使用本試劑盒的實驗室,應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理

2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理

3. 各區(qū)域物品均為專用,不得交叉使用,以免污染檢測結(jié)束后,應(yīng)立即對工作臺清潔

4. 吸取反應(yīng)液時,應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡 PCR 儀前,應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確

5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時離心;

6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),并單獨存放

7. 為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標(biāo)記

8. 檢測過程中使用過的吸頭,應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管,切忌開蓋,并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄工作臺及各種實驗用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒

9. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置;不同批號試劑不能混用并在有效期內(nèi)使用

 


免責(zé)聲明

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