質粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點。如果要克隆較小的dna片段(<10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。但在實際工作中, 如何區(qū)分插入有外源DNA的重組質粒和無插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過調整連接反應中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進一步采取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來zui大限度的降低載體的自身環(huán)化,還可以利用遺傳學手段如α互補現(xiàn)象等來鑒別重組子和非重組子。

外源DNA片段和質粒載體的連接反應策略有以下幾種：

1、帶有非互補突出端的片段 用兩種不同的限制性內切酶進行消化可以產生帶有非互補的粘性末端,這也是zui容易克隆的DNA片段，一般情況下,常用質粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴增時，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。

2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。 由于質粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應中外源片段和質粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細調整連接反應中兩種DNA的濃度, 以便使正確的連接產物的數(shù)量達到zui高水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團用堿性磷酸酯酶去掉, zui大限度地抑制質粒dna的自身環(huán)化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產生一個帶有兩個缺口的開環(huán)分子,在轉入E. coli受體菌后的擴增過程中缺口可自動修復。

3、帶有平末端 是由產生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產生，或由DNA聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應中，T4 dna連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進DNA分子凝聚成聚集體的物質以提高轉化效率。

特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli dna聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端轉變?yōu)榛パa末端或轉為平末端后再進行連接。

本實驗所使用的載體質粒DNA為PBS,轉化受體菌為E. coli DH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ基因,故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補現(xiàn)象篩選相結合的方法。

因pBS帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉化受體菌后只有帶有pBS DNA的轉化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來;而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。

pBS上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。E. coli DH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下,pBS和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5α融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現(xiàn)互補的現(xiàn)象叫α-互補。由α-互補產生的Lac+ 細菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到pBS質粒的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變, 表達蛋白失活, 產生的氨基酸片段失去α-互補能力, 因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上，α-互補產生的Lac+細菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養(yǎng)基中的乳糖，產生乳酸，使pH下降，因而產生紅色菌落，而當外源片段插入后，失去α-互補能力，因而不產生β-半乳糖苷酶，無法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色。由此可將重組質粒與自身環(huán)化的載體DNA分開。此為α-互補現(xiàn)象篩選。

材料、設備及試劑

一、 材料

外源DNA片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA溶液,濃度已知; 載體DNA: pBS質粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互補能力的菌株。

二、 設備

恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋， 瓊脂糖凝膠電泳裝置， 電熱恒溫培養(yǎng)箱，電泳儀無菌，工作臺， 微量移液槍，eppendorf管。

三、 試劑

1、連接反應緩沖液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫蘇糖醇(DTT)(過濾滅菌)，500μg/ml 牛血清清蛋白(組分V.Sigma 產品)(可用可不用)，10mol/L ATP(過濾滅菌)。

2、T4 DNA連接酶(T4 DNA ligase);購買成品。

3、X-gal儲液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的儲液, 包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞, 儲存于-20℃。

4、IPTG儲液(200mg/ml): 在800μl蒸餾水中溶解200mg IPTG后,用蒸餾水定容至1ml,用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝于eppendorf管并儲于-20℃。

5、麥康凱選擇性培養(yǎng)基(Maconkey Agar)：取52g麥康凱瓊脂加蒸餾水1000ml，微火煮沸至*浴解，高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲存液使終濃度為50mg/ml，然后搖勻后涂板。

6、含X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基：在事先制備好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal儲液和4μlIPTG儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置3-4小時,使培養(yǎng)基表面的液體*被吸收。

7、感受態(tài)細胞制備試劑: 見第三章。

8、煮沸法快速分離質粒試劑: 見*章。

9、質粒酶及電泳試劑: 見第二章。

操作步驟

一、 連接反應

1、取新的經滅菌處理的0.5ml eppendorf管, 編號。

2、將0.1μg載體DNA轉移到無菌離心管中，加等摩爾量(可稍多)的外源DNA片段。

3、加蒸餾水至體積為8μl,于45℃保溫5分鐘,以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0℃。

4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混勻后用微量離心機將液體全部甩到管底,于16℃保溫8-24小時。

同時做二組對照反應，其中對照組一只有質粒載體無外源DNA;對照組二只有外源DNA片段沒有質粒載體。

二、 E. coli DH5α感受態(tài)細胞的制備及轉化

每組連接反應混和物各取2μl轉化E. coli DH5α感受態(tài)細胞。具體方法見第三章。

三、 重組質粒的篩選

1、每組連接反應轉化原液取100μl用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上,37℃下培養(yǎng)半小時以上,直至液體被*吸收。

2、倒置平板于37℃繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時,待出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落時拿出平板。

3、放于4℃數(shù)小時,使顯色*(此步麥康凱培養(yǎng)基不做)。

不帶有pBS質粒DNA的細胞,由于無Amp抗性,不能在含有Amp的篩選培養(yǎng)基上成活。帶有pBS載體的轉化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱篩選培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為紅色菌落。在X-gal和ITPG培養(yǎng)基上為藍色菌落。帶有重組質粒轉化子由于喪失了β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱選擇性培養(yǎng)基和x-gal和ITPG培養(yǎng)基上均為白色菌落。

四、 酶切鑒定重組質粒

用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時。使用煮沸法快速分離質粒DNA直接電泳，同時以煮沸法抽提的pBS質粒做對照，有插入片段的重組質粒電泳時遷移率較pBS慢。再用與連接未端相對應的限制性內切酶進一步進行酶切檢驗。還可用雜交法篩選重組質粒。

[注意] 1、DNA連接酶用量與DNA片段的性質有關，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。

2、在連接帶有粘性末端的DNA片段時，DNA濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時，需加入DNA濃度至100-200mg/ml。

3、連接反應后，反應液在0℃儲存數(shù)天，-80℃儲存2個月，但是在-20℃冰凍保存將會降低轉化效率。

4、粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩(wěn)定，所以盡管T4 DNA連接酶的zui適反應溫度為37℃，在連接粘性末端時，反應溫度以10-16℃為好，平齊末端則以15-20℃為好。

5、在連接反應中，如不對載體分子進行去5'磷酸基處理，便用過量的外源DNA片段(2-5倍)，這將有助于減少載體的自身環(huán)化，增加外源DNA和載體連接的機會。

6、麥康凱選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當抗生素時，攜有載體DNA的轉化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落。該產品篩選效果同藍白斑篩選，且價格低廉。但需及時挑取白色菌落，當培養(yǎng)時間延長，白色菌落會逐漸變成微紅色，影響挑選。

7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶(b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside)，為非生理性的誘導物，它可以誘導lacZ的表達。

8、在含有X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落，平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時可使顯色反應充分，藍色菌落明顯。