基本原理

限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶(水解磷酸二酯鍵)。根據(jù)酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。通常所指的DNA限制性核酸內(nèi)切酶就是Ⅱ型酶。

主要試劑

重組質(zhì)粒DNA 插入片段300bp

本實驗所用限制性核酸內(nèi)切酶為EcoRⅠ，其識別順序為：

5′----G↓AATT C----3′

3′----C TTAA↑G----5′

磷酸二脂鍵斷裂 產(chǎn)生5′粘性末端。

操作步驟

1. 反應(yīng)體系的建立：

⑴ 在一無菌1.5 ml eppendorf管中加入：

無菌雙蒸水 7 μl

10×酶切緩沖液 2 μl

質(zhì)粒DNA(100 ng/μl) 10 μl

EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl

總體積為20μl

⑵ 輕輕混勻，12000 rpm離心5 sec。

2. 37 ℃水浴1 h。

3. 將Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通過加熱使酶失活以終止反應(yīng)。

4. 12000 rpm離心5 sec，將管蓋及管壁上的水離下。

5. 取10 μl消化產(chǎn)物，與2 μl 6×上樣緩沖液混勻，瓊脂糖凝膠電泳檢測消化效果，電泳條件：約100 V 30～60 min。

6 結(jié)果觀察。

操作注意事項：

1. 吸樣量一定要準(zhǔn)確

2. 為了不使酶污染而導(dǎo)致浪費(fèi)，zui后才加酶

3. 要求在冰上操作，并充分混勻，

4. 開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內(nèi)面，以防污染。

5. 樣品在37 ℃與65 ℃保溫時，將離心管蓋嚴(yán)，以防水進(jìn)入管內(nèi)造成實驗失敗。

限制性內(nèi)切酶酶解中常見的問題和原因

1. DNA*沒有被限制性內(nèi)切酶切割：①限制性內(nèi)切酶失活;②DNA不純，含有SDS、有機(jī)溶劑、EDTA等;③非限制性內(nèi)切酶*反應(yīng)條件;④酶切位點被修飾;⑤DNA上不存在該酶的識別順序。

2. DNA切割不*：①限制性內(nèi)切酶活性下降或稀釋不正確;②DNA不純或反應(yīng)條件不佳;③酶切位點被修飾;④部分DNA溶液粘在管壁上;⑤酶切后DNA粘末端退火。

3. DNA片段數(shù)目多于理論值：①限制性內(nèi)切酶星號活力;②存在第二種限制性內(nèi)切酶污染;③樣品DNA中含有其它DNA。