引物在PCR反應中處于關鍵作用，引物決定著擴增的特異性和擴增的效率。而在目前DNA的化學合成技術非常成熟的情形下，引物設計是否合適是我們應更為關注的層面。現在有很多的免費的軟件或網絡資源(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)能輔助我們進行引物設計，這使我們總能找到適合我們自己應用的引物設計工具。筆者用得較多的引物設計軟件有oligo 6.0，Primer premier 5。需要說明的是經過細致推敲和計算的引物并不能保證擴增一定能夠成功或，但嚴密的設計并系統地考慮一些應該避免的問題，能使我們在大多數情形下找到我們所需要的引物。 筆者接觸PCR較早，較多地從事引物設計也有一年多的時間，其間也得到過許多老師的幫助指教，現將一些體會整理出來，希望能對大家有一些幫助，同時也盼望能得到更多的指點。

簡單擴增體系中引物設計原則：

簡單體系，是指擴增體系中模板較為單一且大部或全部模板序列已知，如經過純化的短片段或純化后的重組質粒等，是相對后面所提的復雜體系而言的一個粗略的分類。以下是一個大致的流程：

1， 考慮實驗本身對這對引物的要求。如：待擴增區域和擴增產物長度，擴增產物是否需要考慮移碼突變，是否需要在引物5’端引入酶切位點和引入哪些酶切位點，是否需要引入點突變，…… 依據具體的實驗而定。實際上，此步應該是zui費時間和精力的一步。

2， 引物的Tm值。主要需要考慮的因素有：I, 反應體系對引物退火溫度的影響;如酶的zui適工作溫度對引物退火溫度的限制等。II,擴增產物的Tm值。引物和產物的Tm值不要相差太大，20攝氏度范圍內較好。定下引物的Tm值范圍之后即可定下引物的長度范圍。

3， 引物的二級結構。包括引物自身二聚體、發卡結構、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結合從而影響引物效率。對于3’末端且5’端突出的引物二聚體，應控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三個連續的堿基互補，因為此種情形的引物二聚體有進一步形成更穩定結構的可能性，引物中間或5’端可適當放寬。發卡結構也以3’端或近3’端對引物-模板結合影響更大，影響發卡結構的穩定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與莖環結構亦有很大的關系。應盡量避免3’末端有發卡結構的引物。

4， 擴增的特異性。好的設計工具會提供一個引物異位引發的評價指標，如oligo 6.0 的false priming efficiency，即異位引發效率，這個值是由程序根據引物自身二級結構的能量、錯配的類型、錯配離3'末端的距離等因素綜合計算而得出，當此值大于200時便很有可能引發擴增。如所用工具無量化指標，則可依據經驗，當引物與模板在非預期位置退火，超過70%的堿基能互補配對，或引物3’末端連續8個或以上堿基配對，則認為有引發的可能。

在簡單擴增體系中，當我們定好上述限制條件，如能找到適合這些條件的引物，便zui大可能地找到適合我們實驗的引物。如不能滿足上述所有條件，則按所列順序依次滿足，總的來說遵循這樣一個秩序：擴增出符合實驗需要的產物→擴增出能夠分辨分離的符合實驗需要的產物→特異地擴增出符合實驗需要的產物。同樣，這一先后秩序也適用于復雜的擴增體系。