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TUNEL FITC 說(shuō)明書(shū)

來(lái)源:常州百代生物科技股份有限公司   2016年01月26日 10:14  

產(chǎn)品簡(jiǎn)介: TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的經(jīng)典方法。本試劑盒采用TUNEL法,應(yīng)用高活性的基因重組末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡細(xì)胞斷裂的DNA 3’-羥基(3’-OH)末端催化摻入熒光素-12-脫氧三磷酸尿苷(FITC-12-dUTP),通過(guò)檢測(cè)FITC-12-dUTP標(biāo)記的DNA的片段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。FITC-12-dUTP記的DNA可以用熒光顯微鏡直接觀察,也可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。本試劑盒已經(jīng)多次優(yōu)化,F(xiàn)ITC-12-dUTP標(biāo)記和未標(biāo)記dNTP處于*搭配比例,這樣在進(jìn)行3’-OH末端核苷酸摻入時(shí),同一個(gè)斷裂的DNA片段末端可以有更多的FITC-12-dUTP摻入,從而大大提高了檢測(cè)的靈敏度,減少了背景反應(yīng)。再加上我們高活性的TdT酶,使得本試劑盒的檢測(cè)信噪比大大提升,而背景非常干凈。

TUNEL FITC末端熒光標(biāo)記凋亡檢測(cè)試劑盒的特點(diǎn):

 

  • 標(biāo)記dNTP與未標(biāo)記dNTP的比例經(jīng)多次優(yōu)化,高信噪比,高靈敏度;
  • TdT酶為基因工程重組產(chǎn)品,活性高,熒光摻入效率高,背景低;
  • 適用于涂片、爬片、石蠟切片和冰凍切片
  • 試劑盒包裝                                                                                                              產(chǎn)品組成

      號(hào)

    規(guī)  

    價(jià)格(元)

    21013

    20T

    1680

    21014

    50T

    3060

    組    分

    20T

    50T

    5×Equilibration Buffer

    1.25ml

    1.25ml×2

    FITC-12-dUTP Labeling Mix

    100ul

    250ul

    Recombinant TdT Enzyme

    20μl

    50μl

    Proteinase K (2mg/ml)

    40μl

    100μl

     

  • 方法步驟:  

  • 樣品預(yù)處理方案
  •  石蠟包埋組織切片
  • 室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5分鐘。更換新的二甲苯再浸泡5分鐘以*脫掉石蠟
  • 100%乙醇浸泡5分鐘,更換新的100%乙醇再浸泡5分鐘
  • 注意:為得到的結(jié)果,蛋白酶K孵育時(shí)間可能需要優(yōu)化。

  • 組織冰凍切片
  • 將破片浸沒(méi)在4%多聚甲應(yīng)溶液(溶于PBS)中,室溫孵育15分鐘
  • 去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周?chē)囊后w
  • 將玻片浸沒(méi)在PBS溶液中,室溫孵育15分鐘
  • 去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周?chē)囊后w。用石蠟筆或指甲油在樣品周?chē)枥L樣品分布的輪廓,便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,切勿讓樣品干燥。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)
  • 用PBS稀釋2mg/ml的蛋白酶K溶液,使其終濃度為 20µg/ml
  • 每個(gè)樣本上滴加100µl稀釋的Proteinase K溶液,使其被全部覆蓋,室溫孵育10分鐘
  • 在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒(méi)清洗樣本2-3次
  • 去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周?chē)囊后w。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)
  •  
  • 固定細(xì)胞,將細(xì)胞片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中,在4放置 25分鐘;
  • 洗滌載玻片,將其浸入PBS中,室溫放置5分鐘。重復(fù)用PBS洗一次;
  • 輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周?chē)囊后w。這時(shí)可用石蠟筆或指甲油在樣品周?chē)枥L樣品分布的輪廓,便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,切勿讓樣品干燥。處理好的樣本放在混盒中保榜樣本的濕潤(rùn);
  • 用PBS稀釋2 mg/ml的蛋白酶K溶液,使其終濃度 為20µg/ml,每個(gè)樣本需要100µl蛋白酶K溶液;
  • 每個(gè)樣本上滴加100µl稀釋的蛋白酶 K溶液,使其被全部覆蓋,室溫孵 育5分鐘(也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton® X -100溶液中,室溫孵育5分鐘進(jìn)行通透處理);
  • 在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒(méi)清洗樣本2-3次;
  • 輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周?chē)囊后w。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)。
  • 標(biāo)記及檢測(cè)
  • 用去離子水將5×Equilibration Buffer稀釋成1×Equilibration Buffer。
  • 滴加100ul  1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域,室溫孵育10-30分鐘。同時(shí),在冰上解凍FITC-12-dUTP Labeling Mix,并且依照表1,準(zhǔn)備足夠量的用于所有實(shí)驗(yàn)和陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液。對(duì)于面積小于5cm2的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng),其體積是50µl,用50µl乘以實(shí)驗(yàn)和陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的數(shù)目來(lái)確定所需TdT孵育緩沖液的總體積。對(duì)于表面積更大的樣本,可成比例的增大試劑體積。
  • 3)   在平衡后的區(qū)域周?chē)梦埼舳嘤嗟?nbsp;Equilibration Buffer,不要讓組織或細(xì)胞發(fā)干, 然后在組織或細(xì)胞上加50ulTdT孵育緩沖液。

    4)  把塑料蓋玻片蓋在細(xì)胞上以保證試劑的平均分布,在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾,將載玻片置于濕盒內(nèi),再將濕盒用鋁箔紙包裹以避免光照, 37孵育60分鐘。

    表1.準(zhǔn)備用于實(shí)驗(yàn)和陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液     

    組    分

    體    積

    (µl/50µl體系)

    樣本數(shù)目

    (實(shí)驗(yàn)+陽(yáng)性對(duì)照數(shù))

    總體積

    (µl)

    dd H2O

    34

     

     

    5×Equilibration Buffer

    10

     

     

    FITC-12-dUTP Labeling Mix

    5

     

     

    Recombinant TdT Enzyme

    1

     

     

     

  • 用梯度乙醇(908070%將切片各浸洗一次,每次3分鐘,逐漸增加水分
  • PBS輕輕潤(rùn)洗切片,并用濾紙吸干玻片上樣本周?chē)嘤嗟囊后w。這時(shí)可用石蠟筆或疏水筆在樣品周?chē)枥L樣品分布的輪廓,便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,切勿讓樣品干燥。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)
  • PBS稀釋2mg/ml蛋白酶K溶液,使其終濃度為20µg/ml
  • 每個(gè)樣本上滴加100µl稀釋后的蛋白酶K溶液,使其被全部覆蓋,室溫孵育20分鐘
  • PBS溶液潤(rùn)洗樣品。輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周?chē)囊后w。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)
  • 5)  移除蓋玻片,并將切片置于PBS溶液中室溫孵育5分鐘。

    6)  輕輕去掉多余液體,換用新鮮的PBS溶液室溫孵育5分鐘。重復(fù)該步驟1次。

    7)  用濾紙輕輕擦掉樣本周?chē)氨趁娴腜BS溶液。

    注意:為了降低背景,可以嘗試載玻片在步驟5用PBS洗一遍之后,再用含0.1% Triton® X-1 00和5mg/ml BSA的PBS洗三次(取代步驟6),每次5分鐘,這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清除較干凈。

    8)  將載玻片浸入裝有PI溶液的染色缸,暗室室溫放置5分鐘,此 處PI溶液是用PBS新配稀釋到1µg/ml的。

    9)  洗滌樣本,將載玻片浸入去離子水中,室溫放置5分鐘,共洗三次。 

    10)  將載玻片上多余的水吸干,但組織或細(xì)胞保持濕潤(rùn)。 

    11)  立即在熒光顯微鏡下分析樣本,用標(biāo)準(zhǔn)的熒光過(guò)濾裝置在520 ± 20 nm的熒光下觀察綠 色熒光。在>620 nm下觀察PI的紅色熒光。如有必要,載玻片可在4 黑暗條件下存放隔夜。

    3. 陽(yáng)性對(duì)照制備:如有必要,可按下述制備陽(yáng)性對(duì)照。

    1)     在樣本預(yù)處理之后,加100ul DNA酶I緩沖液到固定的細(xì)胞上,室溫孵育5分鐘;

    2) 輕去液體,加入100µl含5.5-10units/ml DNA酶I的緩沖液,室溫孵育10分鐘;

    3) 輕叩載玻片去掉多余的液體,并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中*洗3-4次。

    注意:陽(yáng)性對(duì)照載波片必須使用單獨(dú)的染色缸。否則來(lái)自陽(yáng)性對(duì)照載玻片上殘余的DNA酶I活性可能會(huì)在實(shí)驗(yàn)載玻片上引入高的背景。

     

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