貼壁生長的IOSE80細胞是用彎口培養瓶培養，培養瓶平放（瓶口向上翹），細胞就貼在瓶底內壁一層生長。瓶底空間有限，當細胞在瓶底生長鋪滿一層時，由于接觸抑制，細胞會停止分裂而進入老化凋亡的狀態。理論上將瓶底平面空間擴大，就能讓細胞有更大的空間繼續生長。在實際操作上，就是把一個瓶的貼壁細胞從瓶底內壁“取下來”，再稀釋分裝到X個新的培養瓶，這就相當于把原來的面積擴大了X倍。就是我們習慣上說的“1傳X”。所謂“傳代”就是這個意思，以細胞分裂來說，這樣的“傳代”并不是指細胞由一個變成兩個，而是已經經過了很多代了。“取下來”的意思不是生刮硬掰，而是用胰蛋

白酶消化液。細胞相互貼住或與瓶壁貼住的機理就是靠細胞表面的蛋白。胰蛋白酶能水解這種蛋白而破壞細胞的粘連，從而消散成團細胞成單個細胞懸液。

操作上：進入無菌室，酒精擦手消毒，無菌風吹干雙手，點燃臺面的酒精燈，培養液和胰酶放到超凈臺上，打開塞子備用。從培養箱中取出一瓶細胞，準備傳代。先準備要用的移液管。一般我是用四根/瓶，兩根5ml的，兩根2ml的。*根移液管（5ml）是用來吸掉培養瓶內舊的培養液的，廢液放到廢液缸。然后用一根新的管（2ml）吸取一點胰酶，滴7～8d到瓶中。這時由于還殘留有舊的培養液，而培養液中的血清是會終止胰酶的消化作用的，所以*次加入的胰酶實際上是清洗作用，當然用PBSbuffer也一樣，只是我貪方便。搖動瓶子，清洗完后用原來加胰酶的管把液體吸走。用第三根管（2ml）再吸胰酶，同樣滴加7～8d入瓶，這時胰酶就是消化用的。擰上蓋子，平放，讓胰酶剛剛覆蓋細胞薄薄一層進行消化。時間不能長，1～2分鐘就應該可以，搖動培養瓶，看底下白色的一層細胞是否能搖下來，細胞散落隨液體流到瓶底，證明消化成功。準備幾個空的培養瓶，用第四根移液管（5ml）吸取一定的新鮮培養液加到細胞消化好的培養瓶中，吹打幾次，讓細胞散開成單個細胞懸液，分裝到多個培養瓶中。擰上蓋子（不要擰緊，讓二氧化碳進入），放到培養箱中進行培養。

換液就是去掉舊的培養液，換入新鮮的培養液，操作如上，就是不用胰酶消化。

這過程看似簡單，但卻有很多要注意的細節。

首先，操作盡量往里。就是說盡量伸進去超凈工作臺一點，因為越是接近工作臺邊緣，細菌飄進的機會就增加，哪怕是有無菌風。

第二，裝培養液的瓶子和裝胰酶的試管打開塞子前要用酒精擦，火上烤干再打開。開口后，開口向操作者傾斜放在架子上。這樣你吸取液體的時候就不用一只手拿著瓶子（試管）了。

第三，永遠不能在開口正上方操作。意思就是說你吸取液體時，培養液瓶或胰酶試管開口保持傾斜，移液管也是傾斜插入瓶內。如果開口就垂直向上，你也必須垂直插入移液管，那么手上或吸耳球上就有可能有一兩個細菌垂直掉進瓶內。還有，取器材時，手要“繞彎”避免在瓶子開口上方空中經過。

第四，吸放一次完成。比如吸掉舊的培養液時一次吸完。如果液體比較多，要分幾次吸時，移液管口不能接觸廢液缸。吸取新鮮培養液到培養瓶時，管口也不能接觸瓶子，要在瓶口吹進去。因為如果接觸到瓶子，管口就可能帶有細胞，如果再放到培養液瓶里面去繼續吸的話，培養液就會被細胞污染。當然，吸夠新鮮培養液后還要吹打，這時就可以接觸，只要你不再吸培養液的話。

第五，移液管要套上一個吸耳球，套球時要注意，左手拿管，右手拿球套上去。關鍵是左手拿管的位置。不能拿管口部分，應該盡量靠上。

第六，一般移液管使用前要在酒精燈上烤一下，就是所謂“過火”。但切記不能烤得太燙，稍微過一下就行了。

如何判斷該傳代還是換液？

首先，培養液中的紅色是因為加了甲基紅，一般剛配好的時候是偏淡的血紅色的。4℃放置一段時間顏色會加深，這是正常的。放到培養箱中因為二氧化碳的作用會變成橙偏紅色。細胞生長會排出偏酸的代謝廢物而使培養液顏色向黃色轉變，如果發現培養液顏色偏黃了，就說明細胞生長旺盛，是時候要傳代/換液了。然后是鏡檢。一般我們會以“滿瓶率”表示。就是細胞鋪滿培養瓶底壁的多少。剛開始時你必須每天觀察，了解細胞生長的速度。細胞剛開始時不多的話，生長可能就會比較慢，但細胞多起來的話生長就會加快。這符合對數生長的規律。一般生長快的細胞鋪滿70％以上就要傳代處理了。這需要一定的經驗判斷。

如何判斷“1傳X”的“X”？

參考書上是寫通過細胞計數調一定濃度的細胞懸液接種到幾個培養瓶……我覺得比較麻煩，所以我是通過鏡檢觀察“滿瓶率”再加上經驗來判斷的。我覺得首先是你要了解細胞生長的速度，根據你實驗的時間表定一個周期。傳代時控制細胞量以配合你的時間表。例如，我培養的細胞生長較旺盛，所以我自己是定了3天為一個周期。一般70％滿的細胞就1傳3，三天后剛好又長到70％滿多一點。每次多一點，到了三四次就會由原來的70％滿變成90％滿，這時就1傳5或6，控制下來。