細(xì)胞培養(yǎng) 支原體污染問題    

細(xì)胞壁，可透過一般過濾膜(0.22-0.45 um)的原核生物，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，因而細(xì)胞培養(yǎng)過程中被支原體污染是一個(gè)世界性的難題。當(dāng)細(xì)胞(特別是傳代細(xì)胞)被支原體污染后，細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA及蛋白表達(dá)發(fā)生改變，而細(xì)胞的生長率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細(xì)胞被支原體污染一般難以察覺。

支原體污染的后果：

細(xì)胞株若受到細(xì)菌、真菌、支原體、或是特定病毒等之污染時(shí)，會嚴(yán)重的影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。而細(xì)菌、真菌等之微生物污染時(shí)，較易自培養(yǎng)基等的外觀變化察覺。但是若受到支原體之污染時(shí)，細(xì)胞之外觀較無明顯變化，但是其污染會造成細(xì)胞之生長速率緩慢、細(xì)胞產(chǎn)生病變之型態(tài)改變等等變化。

支原體污染 如何預(yù)防和控制：

設(shè)備方面:

1、使用已作支原體測試ok之細(xì)胞株

2、于另一隔離之區(qū)域操作未知是否有支原體污染之細(xì)胞

3、使用不添加抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞

檢測方面:定期以標(biāo)準(zhǔn)的支原體檢測方法檢測細(xì)胞、培養(yǎng)基、血清、ddH2O有否被支原體污染。

實(shí)驗(yàn)操作人員之無菌觀念與無菌操作技術(shù)之要求

支原體污染問題：

1、應(yīng)如何避免細(xì)胞污染?

細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原體。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。

2、如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理?

直接滅菌后丟棄之。

3、支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞，是否能以肉眼觀察出異狀?

不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。

4、支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響?

支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

5、偵測出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)，該如何處理?

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。

支原體檢測：

直接培養(yǎng)法

原理:直接培養(yǎng)支原體于培養(yǎng)基中，觀察其生長及菌落生成。

特點(diǎn):是目前zui直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其它偵測新步驟之標(biāo)準(zhǔn)步驟。

缺點(diǎn):培養(yǎng)時(shí)間長，須3-5星期才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(例如M. hyorhinis)。需同時(shí)培養(yǎng)支原體株作為正反應(yīng)對照組，可能會造成污染。

材枓:dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無菌培養(yǎng)皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養(yǎng)箱、厭氧缸(厭氧缸長期培養(yǎng)易有污染，所以厭氧包應(yīng)用無菌水，每次打開厭氧缸后，用70% ethanol擦拭內(nèi)壁。)

培養(yǎng)基制備:

基本配方為Difco PPLO broth(60%), 馬血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培養(yǎng)時(shí)間長，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1:2000)至培養(yǎng)基中以防止其它細(xì)菌污染。

· 10x stock solution (1 liter) :稱取50 gdextrose，10 gL-arginine HCl，溶于1 liter蒸餾水中。以0.22μm無菌過濾膜過濾滅菌。分裝100 ml至瓶中，保存于-70℃。

· 液體培養(yǎng)基(1 liter) :稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 gphenol red 于600ml蒸餾水中，加熱攪拌溶解之。滅菌121℃，15分鐘。待溫度降低至室溫后，于無菌操作臺內(nèi)加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均勻后，分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中，10ml/管。保存于4℃，期限1個(gè)月。

· 固體培養(yǎng)基(1 liter ):稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 gphenol red，15gBacto agar于600ml蒸餾水中，加熱溶解之。滅菌121℃，15分鐘。放在50℃水中浴中，待溫度降低至50℃時(shí)，于無菌操作臺內(nèi)加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解凍之10x stock solution，混合均勻后，倒入60x50㎜之無菌培養(yǎng)皿中，5ml/培養(yǎng)皿。保存于4℃，期限1個(gè)月。

步驟:

· 取1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液或0.2ml細(xì)胞懸浮液，接種于液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)二周，觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養(yǎng)一周及二周后，分別取0.1 ml液體培養(yǎng)液涂在agar plate上，將其倒放置于37℃厭氧箱培養(yǎng)，培養(yǎng)至少3星期，持續(xù)觀察是否有支原體之菌落出現(xiàn)。

· 另取1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液或0.2ml細(xì)胞懸浮液，涂抹在agar plate上，37℃厭氧培養(yǎng)3星期，持續(xù)觀察是否支原體菌落出現(xiàn)。

· 另作正負(fù)反應(yīng)對照組，正反應(yīng)對照組為Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與M. arginini (ATCC 23838)。負(fù)反應(yīng)對照組為待測細(xì)胞之新鮮培養(yǎng)基。

結(jié)果判讀：

· 支原體生長較慢，所以先在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)1~2周增殖后，再培養(yǎng)于agar plate上。需至少培養(yǎng)3星期后，才可斷定是否有支原體污染。所以整個(gè)測試需5個(gè)星期才知正確結(jié)果。

· 典型之支原體菌落類似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原體往agar下層生長所致，為圓形無色透明菌落，大小約10-55μm。但是并非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落，有些是圓形菌落或是類似粘菌類形態(tài)(slime)。

· 若要區(qū)分細(xì)胞或是氣泡造成的類似菌落，可將其自agar plate上切下，重新培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一星期后再種入agar plate，若是細(xì)胞則不會生長。